Western Blots. Johannes A. Schmid
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- Jürgen Lichtenberg
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Transkript
1 Western Blots Monoklonaler Anti-c-myc von Boehringer (# )...2 Polyklonaler Anti-c-myc Tag (cat#06-549/Lot#14966)...2 Anti-X-Press (# /Lot#800969)...2 Monoklonaler Anti-P-Tag (H902-ascites)...3 Polyklonaler Anti-Flag von Santa Cruz (D-8/ cat#sc807/lot#b057)...3 M1 Monoklonaler Anti-FLAG M1 von Kodak (cat#13001)...4 Polyklonaler Anti-IKB-α (C-21/cat#sc-371/Lot#A058)...5 Polyklonaler Anti-Traf-1 (H-186/cat#sc-7186/Lot#Do18)...5 Polyklonaler Anti-Traf-2 (H-249/cat#sc-7187/Lot#Do88)...5 Anti-HA-HRP-konjugiert (Böehringer cat# )...6 Anti-myc-HRP conjugated (Invitrogen, # )...6 Anti-TAK1 (Santa Cruz, rabbit polyclonal, #sc-7162, Lot: J227)...6 Anti-FLAG (M2): Monoclonal mouse ab, Sigma F3165, Lot: 68H Polyklonaler Anti-GFP (Clontech.cat#8363-1)...7 Anti-Phospho-p38...8
2 Monoklonaler Anti-c-myc von Boehringer (# ) 2. Waschen: 2x 2 min PBS def./0,1% Tween Inkubation mit 1. Antikörper: monocl. anti-c-myc 1:200 in PBS def./0,1% Tween 20 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 C inkubieren 5. Inkubation mit 2. Antikörper: anti-mouse-ig-hrp 1:5000 (Amersham NA 931, Batch ) in PBS def./0,1% Tween 20: 1 Stunde bei R.T. 6. Waschen: 3x kurz, 1x 15 min und 2x 5 min mit PBS def./0,1% Tween 20 Polyklonaler Anti-c-myc Tag (cat#06-549/Lot#14966) 3. Inkubation mit 1. Antikörper: polykl. anti-c-myc 1:1000 in 1x PBS def./0,1% Tween 20, 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 C inkubieren 5. Inkubation mit 2. Antikörper: anti-rabbit-ig-hrp 1:5000 (Amersham NA 934, Batch 103 ) in 1x PBS def./0,1% Tween 20: 1 Stunde bei R.T. Anti-X-Press (# /Lot#800969)
3 3. Inkubation mit 1. Antikörper: anti-x-press 1:5000 in 0,1% BSA /1x PBS def./0,1% Tween 20, 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 C inkubieren 5. Inkubation mit 2. Antikörper: anti-mouse-ig-hrp 1:5000 (Amersham NA 931, Batch ) in 1x PBS def./0,1% Tween 20: 1 Stunde bei R.T., Exponieren auf Film, bzw. Detektion am LumiImager Monoklonaler Anti-P-Tag (H902-ascites) 1. Blocken mit 2% Magermilch / 1x PBS def.-0,05% Tween 20: 30 min schütteln lassen 2. Waschen: 2x kurz, 1x 15 min und 2x 5 min mit 1x PBS def./0,05% Tween Inkubation mit 1. Antikörper: monocl. anti-p-tag 1:2000 in 0,2% Trockenmilch/1x PBS def./0,05% Tween 20 über Nacht bei 4 C inkubieren (1:1000 verdünnen, wenn man 1 Std. bei RT inkubiert) 4. Waschen: 2x kurz, 1x 15 min und 2x 5 min mit 1x PBS def./0,05% Tween Inkubation mit 2. Antikörper: anti-mouse-ig-hrp 1:5000 (Amersham NA 931, Batch ) in 1x PBS def./0,05% Tween 20: 1 Stunde bei R.T. 6. Waschen: 3x kurz, 1x 15 min und 2x 5 min mit 1x PBS def./0,05% Tween 20 Polyklonaler Anti-Flag von Santa Cruz (D-8/ cat#sc807/lot#b057)
4 3. Inkubation mit 1. Antikörper: polykl. anti-flag 1:1000 in 1x PBS def./0,1% Tween 20 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 C inkubieren 5. Inkubation mit 2. Antikörper: anti-rabbit-ig-hrp 1:5000 (Amersham NA 934, Batch 103 ) in 1x PBS def./0,1% Tween 20: 1 Stunde bei R.T. M1 Monoklonaler Anti-FLAG M1 von Kodak (cat#13001) 1. Blocken mit 5% Magermilch/50 mm Tris(50 ml 1 M Tris bei 1l)+ 200 mm NaCl(40 ml 5 M NaCl)+ 2 mm CaCl 2 (2 ml 2 M CaCl 2 ) 1 Stunde schütteln lassen 2. Waschen: 3x kurz 50 mm Tris(50 ml 1 M Tris bei 1l)+ 200 mm NaCl(40 ml 5 M NaCl)+ 2 mm CaCl 2 (2 ml 2 M CaCl 2 ) 3. Inkubation mit 1. Antikörper: monocl. M1 anti-flag 1:500 in 50 mm Tris(50 ml 1 M Tris bei 1l)+ 200 mm NaCl(40 ml 5 M NaCl)+ 2 mm CaCl 2 (2 ml 2 M CaCl 2 ) Inkubation 1 Stunde bei R.T. 4. Waschen: 2x kurz, 1x 15 min und 2x 5 min mit 50 mm Tris(50 ml 1 M Tris bei 1l)+ 200 mm NaCl(40 ml 5 M NaCl)+ 2 mm CaCl 2 (2 ml 2 M CaCl 2 ) 5. Inkubation mit 2. Antikörper: anti-mouse-ig-hrp 1:5000 (Amersham NA 931, Batch ) in 50 mm Tris(50 ml 1 M Tris bei 1l)+ 200 mm NaCl(40 ml 5 M NaCl)+ 2 mm CaCl 2 (2 ml 2 M CaCl 2 ) 1 Stunde bei R.T. 6. Waschen: 3x kurz, 1x 15 min und 2x 5 min mit 50 mm Tris(50 ml 1 M Tris bei 1l)+ 200 mm NaCl(40 ml 5 M NaCl)+ 2 mm CaCl 2 (2 ml 2 M CaCl 2 )
5 , Exponieren auf Film, bzw. Detektion am LumiImager Polyklonaler Anti-IKB-α (C-21/cat#sc-371/Lot#A058) 3. Inkubation mit 1. Antikörper: polykl. anti-ikb-α 1:500 in 1x PBS def./0,1% Tween 20, 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 C inkubieren 5. Inkubation mit 2. Antikörper: anti-rabbit-ig-hrp 1:5000 (Amersham NA 934, Batch 103 ) in 1x PBS def./0,1% Tween 20: 1 Stunde bei R.T. Polyklonaler Anti-Traf-1 (H-186/cat#sc-7186/Lot#Do18) Polyklonaler Anti-Traf-2 (H-249/cat#sc-7187/Lot#Do88) 1. Blocken mit 5% Magermilch / 1x PBS def.-0,05% Tween 20: 30 min schütteln lassen 2. Inkubation mit 1. Antikörper: polykl.cl. anti-traf 1/2 1:500 in 5% Magermilch/1x PBS def./0,05% Tween 20, 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 C inkubieren 3. Waschen: 2x kurz, 1x 15 min und 2x 5 min mit 1x PBS def./0,05% Tween Inkubation mit 2. Antikörper: anti-rabbit-ig-hrp 1:5000 (Amersham NA 934, Batch 103 ) in 1x PBS def./0,05% Tween 20: 1 Stunde bei R.T. 5. Waschen: 3x kurz, 1x 15 min und 2x 5 min mit 1x PBS def./0,05% Tween Detektion mit dem Pierce SuperSignal Reagenz: 125 µl/cm 2 Blot, 2 Lösungen im
6 Anti-HA-HRP-konjugiert (Böehringer cat# ) 1. Blocken mit 1% BSA / 50 mm Tris/ 200 mm NaCl/ 0,1% Tween 20: 1 Stunde schütteln 2. Inkubation mit 1. Antikörper: anti-ha-hrp 1:1000 in 1% BSA / 50 mm Tris/ 200 mm NaCl/ 0,1% Tween 20, 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 C inkub. 3. Waschen: 3x kurz, 1x 15 min und 2x 5 min mit 50 mm Tris/ 200 mm NaCl/ 0,1% Tween Detektion mit dem Pierce SuperSignal Reagenz: 125 µl/cm 2 Blot, 2 Lösungen im 5. Exponieren auf Film, bzw. Detektion am LumiImager Anti-myc-HRP conjugated (Invitrogen, # ) 1. Block: 5% dry milk in TBS 2. Wash 2x 5 min with TBS/0.05% Tween-20 (TBS/T) 3. Antibody: anti-myc-hrp (1:2000 in blocking buffer): 2 h at r.t. or over night at 4 C 4. Wash 2x 5 min with TBS/T 5. Wash once for 5 min with TBS 6. Detection with Pierce SuperSignal or equivalent Anti-TAK1 (Santa Cruz, rabbit polyclonal, #sc-7162, Lot: J227) 1. Block: 30 min with 5% dry milk in TBS (or PBS) 2. Wash briefly with TBS 3. 1 st antibody: anti-tak1 (1:500 or 1:1000 in TBS): 1 h at r.t. or over night at 4 C 4. Wash 3 x 5 min with TBS/0.05% Tween nd antibody: anti-rabbit-ig-hrp 1:5000 in TBS/T (Amersham NA 934): 1 h at r.t. 6. Wash 3 x 5 min with TBS/0.05% Tween Detection with Pierce SuperSignal or equivalent
7 Anti-FLAG (M2): Monoclonal mouse ab, Sigma F3165, Lot: 68H Block with 5% dry milk in TBS (1 h at 37 C) 2. Wash 2x 2 min with TBS 3. 1 st antibody: anti-flag M2 (1:1000 in TBS or in blocking buffer): 30 min 1 h at r.t. 4. Wash 3x 2 min with TBS 5. 2 nd antibody: anti-mouse-ig-hrp (1:5000 in TBS or blocking b., Amersham NA931) 30 min 1 h at r.t. 6. Wash 3x 15 min with TBS 7. Detection with Pierce SuperSignal Polyklonaler Anti-GFP (Clontech.cat#8363-1) 3. Inkubation mit 1. Antikörper: polykl. anti-gfp 1:1000 in 1x PBS def./0,1% Tween- 20, 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 C inkubieren 5. Inkubation mit 2. Antikörper: anti-rabbit-ig-hrp 1:5000 (Amersham NA 934, Batch 103 ) in 1x PBS def./0,1% Tween 20: 1 Stunde bei R.T. Exponieren auf Film, bzw. Detektion am LumiImager
8 Anti-Phospho-p38 1. Block: 3% milk in PBS/0.1%Tween 20 (PBS/T): 30 min 2. 1 st antibody (New England Biolab, Diana Mechtcheriakova) 1:1000 in Block: 1 h at r.t. 3. Wash: 3x 5 min in PBS/T 4. 2 nd antibody: anti-rabbit Ig-HRP 1: 2500 (Amersham): 1 h at r.t. 5. Wash: 3x 5 min in PBS/T 6. Detection with Pierce SuperSignal or equivalent
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Durchschnitts- Grenz- Solidaritäts- Gesamt Durchschn.- Grenz- Einkommen Steuer steuersatz zuschlag KiSt 9% Steuer
16.000,00-0% 0% - - - 0% 0% 16.100,00 12,00 0% 12% - 1,08 13,08 0% 13% 16.200,00 26,00 0% 14% - 2,34 28,34 0% 15% 16.300,00 40,00 0% 14% - 3,60 43,60 0% 15% 16.400,00 54,00 0% 14% - 4,86 58,86 0% 15% 16.500,00
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