Versuch 5: Immunologie

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1 Immunologie 5-1 Versuch 5: Immunologie Versuche: 1. ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), Enzymgekoppelter Immunnachweis 2. Western-Blot 3. Test zur Schwangerschaftsfrüherkennung aus Urin Analyse 1. IgG-Test mittels ELISA, 2 Proben (A und B) Wissensgebiete Allgemeine Struktur und grundsätzlicher Aufbau von Antikörpern Klassen der Immunglobuline Prinzip der humoralen und zellulären Immunantwort Wechselwirkung zwischen Antigen und Antikörper Komplementsystem Polyklonale und monoklonale Antikörper Prinzip der Herstellung monoklonaler Antikörper Prinzip von ELISA, Enzyme Linked Immunosorbent Assay Western Blot Blut, Serum, Plasma

2 Immunologie 5-2 I. ELISA Medizinische Grundlage: Antikörper sind Proteine, die vom Immunsystem des Körperss produziertt werden, um eine hochspezifische extrazelluläre Abwehr gegen Infektionen aufzubauen. Außerhalb des Körpers, im Labor, sind Antikörper unentbehrliche Werkzeuge geworden, die in einer Vielzahl von Methoden die Bindungseigenschaften der Antikörper zur qualitativen und quantitativen Analyse von Antigenen nutzen. Im Praktikum werden Sie anhand vonn drei Beispielen einen ersten Einblick bekommen. Der Gebrauch von Enzym-markierten Antikörpern ist eine weit verbreitete Methode zur Detektion von Antigenen und hat die radioaktiven Markierungsmethoden mit dem Nachweis imm RIA (radio immuno assay) in vielen Bereichen verdrängt. Der Aufbau eines ELISA kannn auf verschiedene Art und Weise erfolgen und hängt von den Anforderungen ab, die an ihn gestellt werden. Generell kann man mehrere m Verfahren unterscheiden, unter anderem: A: Direkt-ELISA, B: indirekter ELISA C: Sandwich-ELISA Sandwich-ELISA Abbildung 5-1: Links: Eine 8x12 Lochplatte für die Durchführung g des ELISA. Rechts: Sandwich- ELISA: 1) Das Loch wirdd mit einem bestimmtenn Antikörper beschichtet: 2) Das Antigen haftet spezifisch an dem Antikörper; 3) Ein weiterer Antikörper gegen das Antigen wird dazugegeben; 4) Ein Antikörper gegen g den Fc-Teil des zweiten Antikörper, ausgestattet mit einem Enzym wird dazugegeben; 6) Das Enzym, meist eine Peroxidase, katalysiert die Farbbildung. [Bildquelle: Wikipedia] Im Praktikum werden Sie aus Zeitgründen die einfachstee Form eines Direkt-ELISA durchführen. Sie sollen humanes IgG (fungiert im Versuchh als Antigen) mit Hilfee eines affinitätsgereinigten, mit Meerettich-Peroxidase gekoppelten Antikörpers aus Kaninchen nachweisen. Im Gegensatz zum Sandwich-ELISA wird im Direkt-ELISA dass Antigen direkt an die Platte gekoppelt und mit einem Enzym-markierten Antikörper detektiert. Alle Immunglobuline besitzen die gleiche Grundstruktur aus vier Untereinheiten, zwei leichten Ketten (je 23 kda) und zwei schweren Ketten (je kda). Die Untereinheiten lagern sich überr Disulfid- Die se- brücken und hydrophobe Wechselwirkungenn zusammen und bilden eine Y-förmige Struktur. zernierten Immunglobuline des Menschen lassen sich in 5 Klassen einteilen, IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, die sich im Typ ihrer schweren Ketten unterscheiden. IgD, IgE und u IgG bestehen nur aus Mono-

3 Immunologie 5-3 meren, IgA liegt typischerweise als Dimer vor, während IgM aus Pentameren der Y-förmigen Struktur besteht. Die Multimere sind dabei sowohl untereinander als auch mit einer sogenannten J-Kette (J=joining) über Disulfidbrücken verbunden. In einem direkten ELISA sollen Sie IgG im Plasma nachweisen, als Leerwert dient Tris gepufferte Salzlösung (TBS). In der Analyse sollen Sie ermitteln, ob in den beiden Proben, die Sie erhalten, humanes IgG vorhanden ist oder nicht. Dazu werden in einem ersten Schritt die Plasmaproteine an eine ELISA-Mikrotestplatte gebunden. Nach dem Blockieren unspezifischer Bindungsstellen der Platte mit Milchproteinen wird ein aus Kaninchen stammender Peroxidase gekoppelter Antikörper zugegeben, der gegen humanes IgG gerichtet ist. Der Nachweis der gebundenen Antikörper erfolgt dann durch die enzymatische Reaktion. Als Substrat dient Tetramethylbenzidin, dessen Umsatz photometrisch bei 450 nm detektiert werden kann. Mit einem ELISA kann die Menge des Antigens bestimmt werden. Geräte: ELISA-Reader 96er Microtiter-Platte Pipetten: Precision rot/blau 500 ml Spritzflasche 15 ml Plastikgefäß mit Schraubdeckel Eppendorf-Reaktionsgefäße Lösungen: Plasma (für die Verdünnungsreihe): Plasma 1: verdünnt Protein-Analysen-Lösungen A und B TBS: Verdünnungspuffer ph 7,4 0,02 %-iges TBS/Tween 20 (Detergenz): Waschpuffer TBS/Tween 5 %-ige Milchpulver in TBS Kaninchen-Anti-Human-IgG Antikörper (Peroxidase gekoppelt; 1:40000 in TBS/Milchpulver) Citrat ph mg/ml Tetramethylbenzidin-Lösung in DMSO (karzinogen) 3 %-ige H 2 O 2 -Lösung 20 %-ige H 2 SO 4 Tabelle 1: Die Ergebnisse der ELISA sind zweckmäßigerweise nach der vorgegebenen Tabelle 1 einzutragen. Plasmaverdünnungsreihe (Doppelbestimmung) Leerwert 1 : : : : : 1, : 3, : 6, Leerwert 1 : : : : : 1, : 3, : 6, Analysen 1. Analyse Student A 1. Analyse Student A 2. Analyse Student A 2. Analyse Student A 1. Analyse Student B 1. Analyse Student B 2. Analyse Student B 2. Analyse Student B Durchführung: 1. Beschichten 2. Die Löcher einer 96-Loch Mikrotiterplatte (12x8) sollen beschichtet werden. Hierzu wird in zwei Spalten jeweils eine Plasma-Verdünnungsreihe in TBS-Puffer (s. Tabelle) hergestellt, und in

4 Immunologie 5-4 eine weitere Spalte die unverdünnten Analysen A und B (ebenfalls je 100µl) aufgetragen (alles in Doppelbestimmung, s. Tabelle 1). Dies wird eine Stunde bei Raumtemperatur (RT) inkubiert (mit geschlossenem Deckel auf dem Tisch stehend). Waschen Die Lösungen werden über dem Waschbecken ausgegossen und dann dreimal mit TBS/T- Puffer gewaschen. Man füllt die Löcher mit dem Waschpuffer aus einer Polyethylen-Spritzflasche, und schüttet sie ebenfalls über dem Waschbecken aus. Anhaftende Tropfen können durch Ausklopfen entfernt werden. 3. Blockieren Um die restlichen Proteinbindungsstellen am Plastik zu blockieren, inkubiert man 30 Minuten lang bei RT mit 200 µl Blockierungsreagenz (5% Milchpulver in TBS). 4. Waschen Blockierungslösung entfernen und dreimal (s. o.) mit TBS/T waschen. 5. Peroxidase-gekoppelter Antikörper je 100 µl Antikörper (Anti-human IgG, 1: in TBS/Milchpulver) pro Loch auftragen und 45 Minuten lang bei RT inkubieren. 6. Waschen Antikörperlösung entfernen, dreimal (s. o.) mit TBS/T und anschließend zweimal mit H 2 O (entsalzt) waschen. 7. Detektion Ansetzen von Substratlösung in 15 ml Plastikgefäßen: 4,5 ml aqua dest., 0,5 ml 1M Na-Actat Puffer (ph 6), 31 µl Tetramethylbenzidin-Lösung (10 mg/ml DMSO, karzinogen), 5 µl 3 %ige H 2 O 2 -Lösung. jeweils 100 µl Substratlösung werden in jedes Loch pipettiert. Danach mindestens 5-10 Minuten inkubieren, bis eine Blaufärbung zu sehen ist. 8. Stoppen der Farbentwicklung je 100 µl 20%ige H2SO4 pro Loch hinzugeben. 9. Messen im ELISA-Reader bei 450 nm (mit Hilfe des Assistenten) 10. Auswerten Tragen Sie die gemessenen Absorptionswerte gegen den Logarithmus der Antigenverdünnung auf.. Geben Sie das Ergebnis der Analyse an (positiv oder negativ). Bestimmen Sie den Verdünnungsfaktor der Analyse durch Vergleich mit dem Standard aus der Plasmaverdünnungsreihe.

5 Immunologie 5-5 II. Western Blot Prinzip: Die Trennung von Proteinen über SDS-Gelelektrophorese ist eine Standardmethode zur Analyse von Proteinen. Um eine spezifische Antigenbindu ung der getrennten Proteine nachzuweisen, überträgt man die Proteine durch Anlegung eines elektrischen Felds auf eine Nitrocellulose-Membran. Diese kann dann nach der Blockierung unspezifischer Bindungsstellen auf der Membran M mit einem spezifischen Antikörper gegen ein bestimmtes Protein inkubiert werden und durch die gekoppelte enzymatische Aktivität eines ersten oder zweiten Antikörpers nachgewiesen werden. Dieser Schritt ist nötig, weil die Antikörper die Proteine im PAGE-Gel nicht binden können. Abbildung 5-2: Schematische Durchführung des Western Blots: 1) Trenunng der Proteine mit Hilfe von Polyacrylamidgelelektrophorese; 2) Transfer auff Nitrocellulose; 3) Die transferierten Proteine mit spezifischem Antikörper binden; 4) Färben des gesuchten Proteins, das von dem spezifischen Antikörper gebunden ist. Mit Hilfe von Western-Blot wird eine Information über die Größe dess Proteins erhalten. Der Western Blot dient z. B. als Bestätigung des Nachweises einer HIV-Infektion, wenn in einem ELISA Antikörper gegen HIV nachgewiesen wurden. Im Western Blot werden vorher isolierte Proteine im SDS-Gel der Größe nach getrenntt und auf dem Blot die Antikörper der Patienten gegen g die verschiedenen Proteine nachgewiesen. Ziel des Versuches ist der Nachweis von humanem IgG inn den in Versuch 2 aufgetrennten Fraktionen. Dieses Experiment schließt sich an Versuchh 2 (Aminosäuren und Proteine P II) an. Die Blotprozedur Proteintransfer auf Nitrozellulosepapier wirdd dort beschrieben. Die Grundlagen und Ergebnisse aus Versuch 2 sollten Sie kennen. Geräte: geblottetee Nitrocellulose (Versuch 2) ) Plastikschale Schüttler Lösungen: TBS-Puffer: 0.15 M NaCl, 50 mm Tris ph 7.4 TBS/T (0.01 % Tween 20 in TBS) TBS/T + 5% Milchpulver Kaninchen-Anti-Human-IgG Antikörper (Peroxidase gekoppelt; 1:15.000) 30%ige H2O2-Lösung 0.3 % 4-Chloronaphtol (in Methanol) (karzinogen!))

6 Immunologie 5-6 Durchführung: die Membran (bereits in Versuch 2 blockiert) wird eine Stunde lang mit 10 ml Kaninchen-Anti- Human-IgG (Peroxidase gekoppelt) (1:15.000) inkubiert (auf dem Schüttler) und dann dreimal für 5-10 min mit jeweils 10 ml TBS/T gewaschen. zweimal kurz mit Wasser gewaschen Farbreaktion: Der Antikörper ist mit Peroxidase gekoppelt, die ein farbloses Substrat (4- Chloronaphtol) zu einem Farbstoff umsetzen kann. Hierzu stellt man kurz vor Gebrauch folgende Lösung her: 0,3 ml 0.3% 4-Chloronaphtol 4,7 ml TBS 5 µl 30%ige H2O2-Lösung Nach Zugabe dieser Lösung (Inkubation auf dem Labortisch) erscheinen auf der Membran farbige Banden, die selektiv die Lage und damit die Größe und Existenz des Antigens anzeigt. Die Färbereaktion wird anschließend mit TBS-Puffer abgestoppt, wenn die erwarteten Banden sichtbar sind. Die Reaktion kann bis zu 10 Minuten dauern. Auswertung: Die Beobachtungen nach der Detektion mit Chloronaphthol werden festgehalten und diskutiert. Hierzu werden, vom oberen Rand der Nitrocellulose ausgehend, sowohl die Markerbanden ausgemessen als auch die Lage aller Proteinbanden. Tragen Sie die Laufstrecke gegen den Logarithmus des Molekulargewichts auf. Bestimmen Sie die Größe der Banden mit Hilfe der Eichgeraden.

7 Immunologie 5-7 III. Test zur Schwangerschaftsfrüherkennung aus Urin Medizinische Grundlage: HCG, humanes Choriongonadotropin, ist ein Glykoproteinhormon, das bereitss kurz nach der Bean, sich fruchtung von der Eizelle sezerniert wird. HCG regt den Gelbkörper (corpus luteum) dazu nicht zurückzubilden, sondern weiterhin Progesteron zu produzieren, so dass keine Menstruation statt- findet. Bei normalemm Schwangerschaftsverlauf kann HCG im Serum bereits 7 Tage nach der Be- einer fruchtung nachgewiesen werden. HCG ist daher ein hervorragender Indikator zur Früherkennung Schwangerschaft, es kann auch im Urin nachgewiesen werden. Die Konzentration steigt während der Frühphase der Schwangerschaftt rasch an. Ein positives Ergebnis kann außer durch eine Schwanger- große schaft nur durch ein sehr selten vorkommendes Chorionkarzinom entstehen, bei dem ebenfalls Mengen HCG sezerniert werden. HCG besteht aus einer und einer ß-Untereinheiten. Die -Untereinheit hat eine große Homologie zu den -Ketten der Hypophysenhormone LH (Luteinisierendes Hormon), FSH (Follikel Stimulieren- der des Hormon) und TSH (Thyroid Stimulierend es Hormon). Außerdem sind 94 der 115 Aminosäuren ß-Untereinheit mit denen des ß-LH identisch. Daher ist es unmöglich, einen immunologischen Nach- eine weis mittels nur eines polyklonalen Antikörpers durchzuführen, da Kreuzreaktionen der Antikörper sichere Bestimmung der Hormone unmöglich machen würde. Nur ein e monoklonaler Antikörper, der gegen ein für HCG spezifischess Epitop in der ß-Kette gerichtet ist, kann zur Diagnostik eingesetzt werden. Abbildung 5-3: Schwangerschaftsteststreifen, schematisch dargestellt. Auf einer hydrophilen Membran sind drei verschiedene Bereiche zu unterscheiden: 1. der Kontrollbereich (K), beschichtet mit polyklonalem Ziege-anti-Maus-IgG Antikörperr (IgG), 2. der Testbereich (T), beschichtet mit polyklonalem Ziegen-anti-HCG-Antikörper (IgG) und 3. der Probenauftragsbereich (A). Dieser Bereich enthält den getrockneten, mit kolloidalem Gold konjugierten monoklonalen Maus-Anti-HCG-Antikörper auf Papierstreifen, der mit der Membran verbundenn ist. Prinzip: Der Versuch wird mit einem hochempfindlichen kommerziell erhältlichen Test ("STORCH-TEST" oder "SCHWANGER JA:NEIN") durchgeführt. Ess handelt sich hierbei umm einen Sandwich-Immun-Assay, der aus einer Kombination von monoklonalen und polyklonalen Antikörpern A besteht. Durch einen chromatographischen Schritt werden die beiden Antikörper mit dem Antigen zusammengebracht und die Aggregation durch eine Goldmarkierung sichtbar gemacht. Die korrekte Testdurchführung ist durch

8 Immunologie 5-8 die Reaktion des markierten Antikörpers mit einem weiteren Antikörper gewährleistet. Die Nachweisgrenze des Tests liegt bei 10 IU HCG/l Urin. Durchführung: Stellen Sie das Testkit mit den Sichtfenstern nach oben auf den Labortisch. Füllen Sie die Pipette mit dem Testurin. Geben Sie exakt fünf Tropfen Testurin (ohne Luftbläschen) in das Probenauftragsloch. Warten Sie eine Minute und lesen Sie das Testergebnis im Sichtfenster ab. Der Test ist nicht verwertbar, wenn sich keine bzw. erst später als nach 5 Minuten eine Linie im Sichtfenster zeigt. Genaue Durchführung laut Beipackzettel Auswertung: Protokollieren Sie das Testergebnis und geben Sie an, welche Probe Sie benutzt haben: 1. Erklären Sie genau, wie Ihr Testergebnis zustande gekommen ist. Warum ist der T-Bereich positiv bzw. negativ? Warum ist der K-Bereich positiv? 2. Erklären Sie, warum bei einer nur mit LH versetzten Probe keine Reaktion im T-Bereich festgestellt werden kann, obwohl die dort vorhandenen polyklonalen Antikörper auch mit LH reagieren.