Phage-Display. Übersicht. Allgemeine Einführung Phage M13 Vektoren Bibliotheken Selektionsablauf Anwendungsmöglichkeiten.

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Sven Raske
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1 Phage-Display Thomas Haarmann AG Dietrich Methodenseminar Biochemie II und Übersicht Allgemeine Einführung Phage M13 Vektoren Bibliotheken Selektionsablauf Anwendungsmöglichkeiten

Phage-Display Selektionstechnik, die darauf basiert, dass Peptide/Proteine/Antikörper auf der Oberfläche von Bakteriophagen präsentiert werden.

2 Phage-Display Selektionstechnik, die darauf basiert, dass Peptide/Proteine/Antikörper auf der Oberfläche von Bakteriophagen präsentiert werden. Die DNA, die das präsentierte Peptid/Protein/Antikörper kodiert befindet sich innerhalb des Bakteriophagen. Kopplung von Geno-/Phänotyp Einfache Identifikation der selektierten Peptide/Proteine/Antikörper durch Sequenzierung der kodierenden DNA. Einfacher Aufbau von zufälligen Bibliotheken durch Klonieren von randomisierten DNA- Sequenzen in den Phagen-Vektor. Filamentöse Bakteriophagen Genus Inovirus f1, fd und M13 sind die bekanntesten (98% homolog) benutzen den F-Pilus zur Infektion Konjugation (horizontaler Gentransfer) spezifisch für E. coli die das F-Plasmid besitzen

3 Größe Aufbau 6,5 nm im Durchmesser nm Länge (abhängig von der Genomgröße) Proteinzylinder umgibt und schützt das Genom Genom einzelsträngiges,, zirkuläres DNA-Molekül (6407 bp) 11 Gene gruppiert nach Aufgaben im Lebenszyklus Replikation Zusammenbau Capsid-Proteine

4 Funktionen der Gene Gen Funktion Aminosäuren Kopien II DNA Replikation 410 X DNA Replikation 111 V Bindung der ssdna 87 VIII Haupt Capsid Protein III Capsid Protein VI Capsid Protein VII Capsid Protein 33 5 IX Capsid Protein 32 5 I Zusammenbau 348 IV Zusammenbau 405 XI Zusammenbau 108 Lebenszyklus I Bindung des Phagen über piii an F + -Pilus zurückziehen des Pilus,, Bindung an TolA (bakterielles Membranprotein) Phagen-DNA wird in die Bakterienzelle eingeschleust

5 Lebenszyklus II pii Synthese des Doppelstrangs (bakterielle Enzyme) Gyrase (Topoisomerase)) katalysiert die Bildung von dsdna supercoils (replikative Form) ein Strang (-) dient als Vorlage zur Transkription und Translation der Phagenproteine Amplifikation der DNA unter Mithilfe von pii (Endonuklease)) und bakteriellen Enzymen mittels eines rolling circle Mechanismus der neue (+)-Strang wird durch pv davor geschützt, wieder zum Doppelstrang gemacht zu werden, 78 Nukleotide bilden einen Hairpin der als Verpackungssignal dient Lebenszyklus III Phagenpartikel An der Membran bildet sich ein Komplex aus pi, piv und pxi,, der zum Zusammenbau des Phagen führt Während des nicht- lytischen Ausschleusens des Phagen wird pv durch pviii ersetzt und die Capsid-Proteine werden angehängt

6 pii pviii Darstellungsmöglichkeiten 2700 Kopien wenn jede Kopie benutzt wird sind nur kurze Peptide (6-8 aa) ) möglich Selektion von Bindungspartnern mit hoher Avidität piii 5 Kopien geeignet für große Proteine Selektion von Bindungspartnern mit hoher Affinität

7 M13-Wildtyp-Vektor Was kann dargestellt werden?

8 Kommerzielle Phagenbanken Phage-Display Selection - Biopanning Binding Binding to immobilised target Washing Plating Amplification of individual clones Test for binding of isolated clones using ELISA Amplification Elution Sequence DNA insert and deduce sequence of displayed peptide

9 scfv-library

10 Phagemid Phagemide bakterieller Replikationsursprung bakterielles Resistenzgen Gen für das Peptid-Phage-Fusionsprotein unter der Kontrolle eines spezifischen, induzierbaren Promotors viraler Replikationsursprung virales Verpackungssignal helper phage (mit nicht-funktionalem Verpackungssignal)

11 Panning

Selektion HIV-Antikörper spezifische Phagen Paramagnetische Kügelchen mit anti- human Antikörper umhüllt Zugabe von HIV- positivem Patientenserum Zugabe der kompletten Phagenbank Bindung der Phagen

12 Selektion HIV-Antikörper spezifische Phagen Paramagnetische Kügelchen mit anti- human Antikörper umhüllt Zugabe von HIV- positivem Patientenserum Zugabe der kompletten Phagenbank Bindung der Phagen wegwaschen der ungebundenen Phagen Humbert, M; 2005 Selektion HIV-Antikörper spezifischer Phagen Paramagnetische Kügelchen mit anti- human Antikörper umhüllt Zugabe von HIV- negativem Serum Zugabe der in der positiven Selektion eluierten Phagen Bindung der Phagen Nicht-gebundene (HIV- spezifische) Phagen im Überstand

Selektion HIV-Antikörper spezifischer Phagen Amplifikation der spezifisch gebundenen Phagen Weitere Selektionsrunden (insgesamt 3-4) Amplifikation individueller Phagen Test der Bindung der isolierten

13 Selektion HIV-Antikörper spezifischer Phagen Amplifikation der spezifisch gebundenen Phagen Weitere Selektionsrunden (insgesamt 3-4) Amplifikation individueller Phagen Test der Bindung der isolierten Phagen an das Target im ELISA Sequenzierung der positiven Phagen 3DEX Antikörper binden selten an lineare Strukturen, sondern meist an konformelle Epitope Identifizierung solcher Epitope ist schwierig (Mutationsstudien) Entwicklung einer Software (3DEX - 3D Epitope explorer) Suche nach exponierten linearen Peptidsequenzen in 3D-Strukturen (pdb-dateien( pdb-dateien) Vergleich mit der Phagensequenz

14 Mirror Image Phage Display natürlich vorkommende Proteine sind aus L-Aminosäuren aufgebaut für therapeutische Anwendungen sind D-Peptide besser geeignet, da sie im Körper nicht so leicht abgebaut werden D-Peptide sind weniger immunogen Phage Display mit den Spiegelbildern der L-Peptide, also mit den D-Peptiden Mirror Image Phage Display Synthese von D-Peptiden ausgehend von den natürlichen L- Peptiden als Target Selektion von passenden L-Peptiden Synthese dieser L-Peptide als D-Peptide D-Peptide binden das originale L-Peptid

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