MOL.504 Analyse von DNA- und Proteinsequenzen

Transkript

1 MOL.504 Analyse von DNA- und Proteinsequenzen

2 Vorbereitung: Start des Serial Cloners ( unter Laufwerk K: im Ordner Win_SerialCloner2-5 Programm direkt im Ordner starten) K:\Win_SerialCloner2-5 (oder 2-6 current version)! Achtung: Programm läuft nicht 100%ig stabil! Daten sichern! Alternativ: Download des Serial-Cloners: Öffnen eines Text-Editors (Word 2010) Öffnen eines WebBrowsers (Firefox)

3 Übersicht Klonieren von Monoglyceride Lipase aus der Maus in den E. coli Expressionsvektor pproex-htb durch die Restriction Sites BamHI und XhoI Arbeitsablauf 1) Vorbereitung des Vektors (a, b) 2) Vorbereitung des Inserts (c ) 3) Primer, (PCR), Schneiden und Ligation (d-h ) 4) Analyse ( i )

4 Ü-K1 Klonieren von Monoglyceride Lipase aus der Maus in den E.coli Expressionsvektor pproex-htb durch Restriction Sites BamHI und XhoI a) Vorbereitung -Vektor Suchen der Sequenz von pproexhtb B im Internet der Firma Life Technolgies Hinweis: Versuchen Sie die Sequenzen direkt vom Hersteller runterzuladen um (Übertragungs)Fehler zu vermeiden Suchen Sie die Plasmid-Map mit der MCS und analysieren Sie den Vektor! (

5 Ü-K1a mmgl in pproex-htb Vektor a) Firma/Vendor: Invitrogen (jetzt Life Technologies!) Welche Antibiotikaresistenz trägt das Plasmid? Gibt es eine MCS? Wie ist Targetprotein in der MCS induzierbar?

6 Ü-K1a mmgl in pproex-htb Vektor und MCS a) Aufbau der MCS: Welche Restriktionsenzyme können benützt werden? Gibt es einen Fusionstag? Wenn ja, kann er mit einer Protease geschnitten werden? Ribosombindestelle

7 Ü-K1b mmgl in pproex-htb Darstellung Vektor in Serial Cloner Darstellung der Sequenz von pproexhtb mittels ev. PlasMapper;

8 Ü-K1b mmgl in pproex-htb Import Vektor in Serial Cloner Darstellen in Serial Cloner speichern als pproexhtb.xdna

9 Ü-K1b mmgl in pproex-htb Serial Cloner Darstellen in Serial Cloner Zirkularisierung des Plasmides (Sequence circularize speichern als cpproexhtb.xdna )

10 Ü-K1b mmgl in pproex-htb Serial Cloner Darstellen in Serial Cloner: Zirkularisierung des Plasmides (Sequence circularize speichern als cpproexhtb.xdna ) - Welche Feature (Tags, Protease-cleavage sites) werden automatisch vom Programm erkannt vgl Sie mit der Vektor-Map vom LifeTechnologies (Features-> Scan Sequnce) Was bedeuted 6His, TEV site

11 Ü-K1c mmgl in pproex-htb Vorbereitung des Inserts (mmgl) Klonieren von Monoglyceride Lipase aus der Maus in den E. coli Expressionsvektor pproex-htb c) Vorbereitung des Inserts Suchen der Proteinsequenz von Monoglyceride Lipase aus der Maus in der Uni-Prot Datenbank (Accession-Nummer O35678) Von dort ausgehend mrna bzw CDS (CoDing Sequence) Sequenz in NCBI (cross-references GenBank), EBI etc etc Überlege: Warum nehmen wir die mrna-sequenz bzw. CDS um ein Mausgen in E. coli zu exprimieren?

12 Ü-K1c mmgl in pproex-htb Vorbereitung des Inserts (mmgl) >gi : Mus musculus mrna for monoglyceride lipase (Mgll gene), transcript 1 ATGCCTGAGGCAAGTTCACCCAGGCGAACTCCACAGAATGTTCCCTACCAGGACCTGCCTCACCTGGTCA ATGCAGACGGACAGTACCTCTTTTGTAGATACTGGAAGCCCAGTGGCACACCCAAGGCCCTCATCTTTGT GTCCCATGGAGCTGGGGAACACTGTGGCCGTTATGATGAGCTGGCTCATATGTTGAAGGGGCTGGACATG CTGGTATTTGCCCATGACCATGTTGGCCATGGGCAGAGTGAGGGAGAGAGGATGGTGGTGTCGGACTTCC AAGTTTTTGTCAGAGATGTGCTGCAACACGTGGACACCATCCAGAAGGACTACCCCGACGTCCCCATCTT CCTCCTGGGCCACTCCATGGGCGGTGCCATCTCCATCCTAGTGGCTGCAGAGAGGCCAACCTACTTTTCT GGCATGGTCCTGATTTCACCTCTGGTCCTTGCCAATCCGGAATCTGCATCGACTTTGAAGGTCCTTGCTG CCAAACTGCTCAATTTTGTCCTGCCAAATATGACCTTGGGGCGCATTGACTCCAGCGTGCTGTCTCGGAA CAAGTCGGAGGTTGACCTGTACAACTCTGACCCACTCGTCTGCCGAGCAGGGCTGAAGGTGTGCTTTGGC ATACAGCTGCTGAATGCCGTCGCAAGAGTGGAGCGAGCAATGCCCAGGCTGACACTGCCATTCCTGCTGC TGCAGGGTTCTGCTGACCGGCTTTGCGACAGCAAAGGTGCCTACCTGCTCATGGAATCATCCCGGAGTCA GGACAAAACACTCAAGATGTATGAAGGTGCCTATCACGTCCTCCACAGGGAGCTTCCGGAAGTGACCAAC TCCGTCCTCCATGAAGTAAACTCGTGGGTGTCTCACAGGATAGCAGCAGCAGGAGCTGGGTGTCCACCCT GA

13 Ü-K1c mmgl in pproex-htb Vorbereitung des Inserts (mmgl) oder >ENA CAA04544 CAA Mus musculus (house mouse) monoglyceride lipase ATGCCTGAGGCAAGTTCACCCAGGCGAACTCCACAGAATGTTCCCTACCAGGACCTGCCT CACCTGGTCAATGCAGACGGACAGTACCTCTTTTGTAGATACTGGAAGCCCAGTGGCACA CCCAAGGCCCTCATCTTTGTGTCCCATGGAGCTGGGGAACACTGTGGCCGTTATGATGAG CTGGCTCATATGTTGAAGGGGCTGGACATGCTGGTATTTGCCCATGACCATGTTGGCCAT GGGCAGAGTGAGGGAGAGAGGATGGTGGTGTCGGACTTCCAAGTTTTTGTCAGAGATGTG CTGCAACACGTGGACACCATCCAGAAGGACTACCCCGACGTCCCCATCTTCCTCCTGGGC CACTCCATGGGCGGTGCCATCTCCATCCTAGTGGCTGCAGAGAGGCCAACCTACTTTTCT GGCATGGTCCTGATTTCACCTCTGGTCCTTGCCAATCCGGAATCTGCATCGACTTTGAAG GTCCTTGCTGCCAAACTGCTCAATTTTGTCCTGCCAAATATGACCTTGGGGCGCATTGAC TCCAGCGTGCTGTCTCGGAACAAGTCGGAGGTTGACCTGTACAACTCTGACCCACTCGTC TGCCGAGCAGGGCTGAAGGTGTGCTTTGGCATACAGCTGCTGAATGCCGTCGCAAGAGTG GAGCGAGCAATGCCCAGGCTGACACTGCCATTCCTGCTGCTGCAGGGTTCTGCTGACCGG CTTTGCGACAGCAAAGGTGCCTACCTGCTCATGGAATCATCCCGGAGTCAGGACAAAACA CTCAAGATGTATGAAGGTGCCTATCACGTCCTCCACAGGGAGCTTCCGGAAGTGACCAAC TCCGTCCTCCATGAAGTAAACTCGTGGGTGTCTCACAGGATAGCAGCAGCAGGAGCTGGG TGTCCACCCTGA Oder

14 Ü-K1c mmgl in pproex-htb Vorbereitung des Inserts (mmgl) Testen von MGL auf Restriktionsschnittstellen (restriction sites): Fasta Sequenz von mmgl in Serial Cloner speichern als mmgl.xdna Wir wollen die Restriktionsstellen BamHI und XhoI verwenden: Kontrolle der DNA von MGL ob diese Restriktionsstellen innerhalb des Gens vorhanden sind. Überlegen Sie, ob diese Restriktionsstellen im Gen bereits vorhanden sein sollten? Was passiert, wenn z.b. BamHI in der coding sequence vorhanden ist? Welche Restriktionsenzyme könne Sie nicht verwenden? Hinweis für SerialCloner: Restriction, Site Usage Table von mmgl.xdna auf Absent sites

15 Ü-K1d mmgl in pproex-htb Primerdesign 1) Forward Primer: mgl_for wir starten bei Aminosäure 2 (d.h. ohne StartMethionin) 5 -atg cct gag gca agt tca ccc agg cga act cca -3 M P E A S S P R R T P nt overlap with forward sequence ending with a G: 5 -cctgaggcaagttcacccag-3 +BamHI restriction site: 5 - ggatcccctgaggcaagttcacccag-3 +5 overhang: 5 - cgagcagaggatcccctgaggcaagttcacccag-3

16 Ü-K1d mmgl in pproex-htb Primerdesign 2) Reverse Primer: mgl_rev (inkl. STOP-codon, XhoI site) 5 -gca gca gga gct ggg tgt cca ccc tga 3 < 912 A A G A G C P P * 3 -cgt cgt cct cga ccc aca ggt ggg act 5 +XhoI restriction site: 5 -gcaggagctgggtgtccaccctgactcgag +overhang for restriction enzyme: 5 -gcaggagctgggtgtccaccctgactcgagcgctggcg-3 mgl_rev: 38 bases, 8AC checksum. 5 -CGCCAGCGCTCGAGTCAGGGTGGACACCCAGCTCCTGC-3

17 Ü-K1e mmgl in pproex-htb Check Primers Check Primers for Hairpins, TM, secondary Structure Final primer order: mgl_for: 5 - cgagcagaggatcccctgaggcaagttcacccag-3 mgl_rev: 5 -CGCCAGCGCTCGAGTCAGGGTGGACACCCAGCTCCTGC-3 Run a PCR reaction with these primers in silico using serial cloner.

18 Ü-K1e mmgl in pproex-htb Check Primers Final primer order: mgl_for: 5 - cgagcagaggatcccctgaggcaagttcacccag-3 mgl_rev: 5 -CGCCAGCGCTCGAGTCAGGGTGGACACCCAGCTCCTGC-3 Run a PCR reaction with these primers in silico using serial cloner.

19 Ü-K1f mmgl in pproex-htb Run PCR Run a PCR reaction with these primers in silico using serial cloner PCR_MGL_primer.xdna

20 Ü-K1g mmgl in pproex-htb Visualisierung Visualisierung ihres Produktes: in silico agarose gel mit PCR-Produkt nach Inkubation mit BamHI und XhoI in silico agarose gel mit Vektor nach Inkubation mit BamHI und XhoI : Virtual Cutter Q: Welche Banden erwarten Sie und in welcher Größe (kb) sollten die entstehenden Fragmente theoretisch sein? Anmerkung: Im Labor führen Sie nun den Restriktionsverdau an Ihrem vorbereiteten Vektor und an ihrem Vorbereiteten Insert durch. Dadurch entstehen sticky ends an Vektor und Insert mit Overlaps die zu BamHI und XhoI passen. Nach Aufreinigugn am Agarose-Gel des geschnittenen Inserts und des geschnittenen Vektors erfolgt die Ligation (i.e. das Zusammenfügen von Vektor und Insert). In silico werden Restriktionsverdau und Ligation gemeinsam durchgeführt.

21 Ü-K1h mmgl in pproex-htb Ligation Ligation cpproexhtb (open vector) mit PCR_MGL_primer (after digest): Build a construct Auswählen der Restriction Sites mit 1-Click und Doppelklick (Achtung Reihenfolge!)

22 Ü-K1h mmgl in pproex-htb Ligation Ligation cpproexhtb (open vector) mit PCR_MGL_primer (after digest): Build a construct Auswählen der Restriction Sites mit 1-Click und Doppelklick (Achtung Reihenfolge!)

23 Ü-K1h mmgl in pproex-htb Ligation Ligation cpproexhtb (open vector) mit PCR_MGL_primer (after digest): Build a construct Auswählen der Restriction Sites mit 1-Click und Doppelklick (Achtung auf Reihenfolge!)

24 Ü-K1i mmgl in pproex-htb Analyse Serial Cloner Analyse innerhalb SerialCloner: Alignment with mmgl; Blast Selected Sequence (Sequence): Was ist die Aussagekraft dieser Analyse? Nachteil: Keine Information ob Insert in Frame ist i.e. START-His-TEV-MGL-STOP => Translation in Sequence Map; His-tag is im translatierten frame MGL auch? Überlegen Sie, wo Ihr Translationsprodukt beginnt! Warum gibt es 6 Frames?

25 Ü-K1j mmgl in pproex-htb Analyse expasy Analyse Alignment with mmgl Keine Information ob Insert in Frame ist i.e. His-TEV-MGL-STOP => Translation in Sequence Map; His-tag is im translatierten frame MGL auch? Translation of Sequence (in Serial cloner, Translate tools (expasy) => Translation in Format Compact (warum?); His-tag is im translatierten frame MGL auch? Überlegen Sie, wo Ihr Translationsprodukt beginnt! Warum gibt es 6 Frames? Use compact

26 20 Nov :02 GMT Frederick Sanger, father of DNA sequencing, dead at 95 Two-time Nobel prizewinner Frederick Sanger died on 19 November, aged 95. Sanger won the 1958 Nobel Prize in Chemistry for developing a method that let him determine the complete amino-acid sequence of insulin a method that has since been widely applied to other proteins. In 1980, he won the chemistry prize again, for discovering a technique for sequencing DNA. An adapted version of Sanger sequencing was later used to decode the human genome for the first time. Science journalist and regular Nature contributer Ed Yong has a rather cryptic tribute on his blog: CGCATTCCGTTTCGCGAAGATAGCGCGAACGGCGAACGC. Translate!

27 Was sollten Sie nun wissen? Welche Utensilien benötige ich für das klassiche Klonieren? Wie funktioniert eine PCR-Reaktion prinzipiell? Welche Features und welche Länge hat ein typischer Expressionvektor? Wie finde ich von meinem Zielprotein die codierende Sequenz? Welche Features kann die mrna tragen? Wann soll die cdna meines Inserts mit/ohne Start- bzw. Stopcodon kloniert werden? Was sind Restriktionsstellen und wie schauen diese typischerweise aus? Wie kann ich die Sequenz von Restriktionsstellen finden Welche Restriktionsstellen sollen am Vektor sein, welche am Insert? Welche Bestandteile hat ein typischer Primer? Wie wird ein forward, wie ein reverse Primer designed? Wie kann ich feststellen, welches Protein im Vektor kodiert wird? Wie kann ich feststellen, ob mein Zielprotein im richtigen Leserahmen (in frame) kloniert wurde? Umgang mit dem Programm Serial Cloner Wie mache ich einen Screenshot (e.g. Snipping tool ) Mit welchen Schriftarten sind Sequence Alingments sinnvoll?