Transgene Organismen

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1 Transgene Organismen

2 Themenübersicht 1) Einführung 2) Komplementäre DNA (cdna) 3) Vektoren 4) Einschleusung von Genen in Eukaryontenzellen 5) Ausmaß der Genexpression 6) Genausschaltung (Gen-Knockout) 7) Einschleusung von Genen in Pflanzenzellen

3 Einführung Eukaryontengene können in Bakterienzellen und in höhere Organismen, also tierische Zellen und solche höherer Pflanzen, eingeschleust werden. Die gentechnisch veränderten Organismen bezeichnet man als transgen.

4 Welchen Nutzen bringen uns transgene Organismen? Bakterien als Proteinfabriken Erkenntnis über Wirkungsweise der Gene Grundlagen der Gentherapie Schädlingsresistenz Erhöhung des Nährstoffgehalts

5 Komplementäre DNA Problem: Introns der Eukaryonten-DNA Aufnahme von zur mrna komplementären DNA (cdna) Bsp. Insulinherstellung

6 Herstellung von cdna Reverse Transkriptase (Retroviren) Bildung eines RNA-DNA-Hybrids Oligo(T)-Primer an Poly(A)-Schwanz der mrna Hydrolyse des RNA-Stranges durch ph- Erhöhung Herstellung von ddna

7 Herstellung von cdna Terminale Transferase Oligo-Primer synthetische Linker zur Ligation in einen Vektor cdna-bibliothek

8 Herstellung von cdna (Stryer: Biochemie, 5.Auflage)

9 Vektoren Einbringen der fremden DNA in die Wirtszelle Plasmide oder Phagen Expressionsvektoren Einfügen der cdna in der Nähe eines starken bakteriellen Promotors

10 Suche nach den cdna-klonen radioaktiv markierte Antikörper Überführung der Bakterien auf eine Replikaplatte Lyse der Bakterien Identifizierung der gesuchten Kolonien durch Autoradiographie

11 Geneinbau in Eukaryotenzellen Problem: Bakterien führen keine posttranslationalen Modifikationen aus. Deshalb können viele eukaryontische Gene nur in eukaryontischen Wirtszellen korrekt exprimiert werden.

12 Geneinbau in Eukaryotenzellen Aufnahme von mit Calciumphosphat gefällten fremden DNA-Molekülen Mikroinjektion mit feiner Glasmikropipette Geneinbau über Viren (Retroviren) Beispiele: Moloney-Mäuse-Leukämie- Virus, Vaccinia-Virus, Baculo- Virus

13 Experiment: Einbringen des Gens für das Wachstumshormon der Ratte in Mäuseeizellen Somatotropingen auf Plasmid neben Metallothioneinpromotors der Maus Initiation der Genexpression durch Gabe von Cadmium

14 Experiment: die transgenen Mäuse wachsen weitaus schneller als die Kontrollmäuse unter Cadmium-Gabe Konzentration des Hormons 500-mal so hoch und Körpergewicht doppelt so hoch wie bei normalen Mäusen Veranschaulichung der Integration und effizienten Expression fremder Gene unter Kontrolle eines neuen Promotors in Säugetierzellen

15 Ausmaß der Genexpression Verwendung von DNA-Chips Durch Hybridisierung der immobilisierten DNA mit fluoreszierender cdna kann man den Expressionslevel des Gens identifizieren Intensität des fluoreszierenden Punktes

16 Genausschaltung (Gen-Knockout) Prinzip: Homologe Rekombination Durch in eine Zelle eingebrachte Fremd-DNA kann ein Gen, dessen Sequenz zumindest in Teilen homolog ist, durch Austausch von Segmenten unterbrochen werden. Bsp.: Gen für gas regulatorische Protein Myogenin

17 Homologe Rekombination (Stryer: Biochemie, 5.Auflage)

18 Einschleusung von Genen in Pflanzenzellen Infektion von Pflanzen durch Agrobacterium tumefaciens (tumorinduzierendes Plasmid) Wurzelhalsgalle (Tumorgewebe) Synthese von Opinen Umstellung des Stoffwechsels der Pflanzenzelle

19 Ti-Plasmid (Stryer: Biochemie, 5.Auflage)

20 Ti-Plasmide als Vektoren Einbau eines fremden DNA-Segments in die T-DNA-Region eines kleinen Plasmids Synthetisches Plasmid in Agrobacterium- Kolonie Rekombination Ti-Plasmide mit dem fremden Gen Problem: Transformation gelingt nicht bei wichtigen monokotylen Getreidepflanzen

21 Weitere Möglichkeiten der Geneinschleusung Elektroporation: Anlegen elektrischer Felder Passierbarkeit der Membran für große Moleküle Genkanonen: mit DNA beschichtete Wolframkügelchen Transformation durch Beschuss

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