Molekulare Präsentationstechniken Phage Display

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1 Molekulare Präsentationstechniken Phage Display Gentechnik und Genomics WiSe 2007/2008 Kristian M. Müller Institut für Biologie III Albert-Ludwigs-Universität Freiburg

2 Pharma-Biotech Umsatz in den USA Nature Biotechnology

3 Wie macht man Antikörper? Immunisierung -> Hybridoma -> Humanisierung Natürliche humane Bibliotheken -> Selektion -> IgG Klonierung Künstliche Bibliotheken -> Selektion -> IgG Klonierung

4 Der neue Weg zu Antikörpern immunology today

5 Neue Bindemoleküle Fab Fn3 Ankyrin Z-Domäne Affibody Lipocalin Anticalin Kamel VH Current Opinion in Structural Biology 2007, 17:481

6 Künstliche Diversität

7 Möglichkeiten der verzufallten Synthese T C A G T C A G UUU F 21.7 UCU S 9.1 UAU Y 16.2 UGU C 5.1 UUC F 16.7 UCC S 8.9 UAC Y 12.4 UGC C 6.4 UUA L 13.4 UCA S 7.6 UAA * 2 UGA * 0.9 UUG L 13.2 UCG S 8.7 UAG * 0.3 UGG W 14.4 CUU L 11.1 CCU P 7 CAU H 12.6 CGU R 21.1 CUC L 10.7 CCC P 5.3 CAC H 9.8 CGC R 21.5 CUA L 3.9 CCA P 8.4 CAA Q 14.7 CGA R 3.6 CUG L 51.9 CCG P 22.8 CAG Q 29 CGG R 5.5 AUU I 29.8 ACU T 9.4 AAU N 18 AGU S 8.8 AUC I 25.1 ACC T 23.1 AAC N 21.8 AGC S 15.7 AUA I 4.9 ACA T 7.5 AAA K 34.4 AGA R 2.5 AUG M 27.4 ACG T 14 AAG K 11.2 AGG R 1.5 GUU V 19 GCU A 16.1 GAU D 32.1 GGU G 25.3 GUC V 14.9 GCC A 25.2 GAC D 19.5 GGC G 29.2 GUA V 11.2 GCA A 20.4 GAA E 39.9 GGA G 8.3 GUG V 25.8 GCG A 32.8 GAG E 18.4 GGG G 11.0 R= A/G Y= C/T M= A/C K= G/T S= C/G W= A/T H= A/C/T B= C/G/T V= A/C/G D= A/G/T N= A/C/G/T T C A G nnk total 32 van total 12 vnn total 48 vdn toal 36 rnn total 32 vwn total 24 dyn total 24 A = Ala C = Cys D = Asp E = Glu F = Phe G = Gly H = His I = Ile K = Lys L = Leu M = Met N = Asn P = Pro Q = Gln R = Arg S = Ser T = Thr V = Val W = Trp Y= Tyr TAG stop

8 Trinukleotide Nucleic Acids Res

9 Künstliche Diversität in einer Antikörperbibliothek

10 Phage Display Phagen koppeln in einer leicht zu handhabbaren und stabilen Form Genotyp und Phänotyp Bevorzugt werden filamentöse Phagen (fd, M13): die Phagengröße kann sich der Genomgröße anpassen die Phagen lysieren die Zellen nicht der Terminus eines Hüllproteins (geniiiprotein) ist leicht zugänglich.

11 Der Lebenszyklus eines filamentösen Phagen

12 Phage im Elektronenmikroskop

13 Figure 4 Der schematische Aufbau eines Phagen P7 (5 Kopien) P6 Peptide of interest Phagen Genom Gene of interest Gene3 C C N2 N2 N1 N1 C N2 N1 P9 (5 Kopien) P8 (ca Kopien) P3 (5 Kopien) ca. 1 µm lang (je nach DNA) ca. 7 nm Durchmesser

14 Das Genom des M13 Phagen

15 Gene und Proteine des Phagen

16 Gen3Protein und Phageninfektion

17 Die Vermehrung eines filamentösen Phagen ca. 100 bis 200 RF DNA in 15 min Molecular Cloning Manual

18 Phage-Display Übersicht Phagenselektion Immunoröhrchen belegen Phagen binden Phagen waschen Phagen eluieren Zellen infizieren Phagenproduktion Titerbestimmung Zellen in Flüssigkultur PEG/NaCl-Fällung Plaques / infizierte Zellen auf Agar-Platte

19 Mirror-Image Phage Display Directed coating of D-peptide via Streptavidin-Biotin. Selection of L-peptide library displayed on phage. Elution Washing Binding step L-Base L-Base

20 Erfinder des Phage Display George P. Smith Born in Norwalk, Connecticut, A.B. degree in biology from Haverfored College, 1963 Year as a high-school teacher and laboratory technician Ph.D. in bacteriology and immunology from Harvard University, Postdoctoral fellowship with Oliver Smithies at the University of Wisconsin Assistant Professor at the Division of Biological Sciences at the University of Missouri in Columbia, 1975 Associate and Full Professor Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science Jun 14;228(4705):1315-7

21 Phage, Phagemid und Helfer-Phage Phagmid ist ein Plasmid mit f1 ori Helfer-Phagen sind verpackungsdefiziente Phagen (z.b. M13K07 mit Mutation im genii) Infektion mit einem Helfer-Phagen führt zur Herstellung von Einzelstrang-DNA und Verpackung des Phagmids.

22 Phagenpräsentations-Formen Phagemid Display Phage Display mosaic Phage Display Helfer Phage geneviii geneiii library Phagmid Smith & Petrenko Chem. Rev. 1997, 97, 391.

23 Disulfidbrücken ermöglichen leichte Elution Bild: Morphosys

24 weitere Selektionstechniken

25 Ribosome Display dsdna In vitro transcription 5 mrna Poly(AAA) 3 In vitro translation RT-PCR Mutagenesis by error-prone PCR 5 Poly(AAA) 3 5 Poly(AAA) 3 Protein tethered to ribosome via cold shock or chloramphenicol Isolation of mrna 5 Poly(AAA) 3 Dissociation of ribosome and release of mrna 5 Poly(AAA) 3 Ligand selection on target Immobilized target

26 Protein-Fragment Complementation Assay (PCA) proteina coding proteina mdhfr frag1 proteinb mdhfr frag2 for plasmid: A-DHFR[1] plasmid: B-DHFR[2] coding for proteinb Amp R Cam R mdhfr fragment1 cotransformation into E. coli mdhfr fragment2 Interacting partners colonies Single-step selection Non-interacting partners no colonies Minimal medium, trimethoprim sequencing growth competition Pelletier et al. Nature Biotechnol. 1999, Arndt et al. JMB 2000, Arndt et al. Structure 2002

27 Finding Interaction Partners for cjun and cfos A) Targeting c-jun target: c-jun + peptide library Selection for interaction c-jun / FosW mdhfr fragment1 mdhfr fragment2 B) Targeting c-fos peptide library + target: c-fos Selection for interaction JunW / c-fos mdhfr fragment1 mdhfr fragment2