Auswertung des Ringversuchs zum Nachweis von PRRS-Virus durch RT-PCR sowie die Differenzierung des US- und EU-Genotyps. Uwe Truyen

Transkript

1 Auswertung des Ringversuchs zum Nachweis von PRRS-Virus durch RT-PCR sowie die Differenzierung des US- und EU-Genotyps Uwe Truyen Institut für Tierhygiene und Öffentliches Veterinärwesen, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig, An den Tierkliniken 1, Leipzig. Die Infektion mit dem porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) ist in den Schweinebeständen weit verbreitet und von großer wirtschaftlicher Bedeutung. Aufgrund der Nukleinsäuresequenz und des antigenen Profils lassen sich ein europäischer und ein amerikanischer Genotyp unterscheiden. Ein Virus des amerikanischen Genotyps wird seit vielen Jahren als Lebendimpfstoff in Europa eingesetzt, seit einigen Jahren ist parallel auch ein Lebendimpfstoff des europäischen Typs im Einsatz. Die PRRSV-Infektion ist nicht mehr anzeigepflichtig, wird tierseuchenrechtlich nicht gemaßregelt. Da das Virus nur schwer kultivierbar ist, basiert die Diagnostik praktisch ausschließlich auf der PCR. Viele Labors diagnostizieren die Infektion mit unterschiedlichen Protokollen. Ziel dieser Untersuchung war es, die Leistungsfähigkeit dieser Methoden anhand von standardisierten Proben in einem Ringversuch zu untersuchen, und die Vergleichbarkeit der unterschiedlichen Laborergebnisse zu erheben. Wie bei allen Ringversuchen war ausdrücklich nicht das Ziel, eine Bewertung der Qualität einzelner Labors vorzunehmen. Es wurden drei Fragestellungen untersucht: 1) Der Nachweis von PRRSV mittels PCR (Grundpaket, 30 Proben) 2) Die Differenzierung von EU- und US-Genotyp (Differenzierungspaket I, 15 Proben) 3) Die Differenzierung von EU-Feldisolaten und dem EU-Impfstamm (Differenzierungspaket II, 15 Proben) - Seite 1 -

2 Insgesamt nahmen 16 Labors an dem Test teil, 13 Labors untersuchten das Grundpaket, 12 das Differenzierungspaket I und zwei das Differenzierungspaket II. Die Ergebnisse sind anonymisiert in den nachfolgenden Tabellen zusammengefasst. Die Proben waren in PBS verdünnte homogenisierte Organproben beziehungsweise Seren infizierter Tiere, virushaltiger Zellkulturüberstand oder mit Virus gespiktes definiertes PRRSV negatives.organmaterial oder Serum. Das Material wurde in 200µl-Aliquots auf Trockeneis an die teilnehmenden Labors verschickt. In Leipzig wurden die Proben nach dem Protokoll von Pesch untersucht. Die von den einzelnen Labors genutzten Protokolle der Nukleinsäureaufarbeitung und der PCR wurden erfasst. Im Folgenden sei das Protokoll, das von den beiden Labors mit der höchsten Erkennungsrate genutzt wurde, zusammengefasst, da es bisher nicht frei zugängig war. Es ist publiziert in: Pesch, Stefan (2003): Etablierung einer Nachweismethode für die zwei Genotypen von PRRSV und ein Beitrag zu seiner molekularen Epidemiologie. Dissertation, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig. - Seite 2 -

3 Probenaufarbeitung: Serum: Organe: QIAmp Viral RNA Mini Kit RNeasy Mini Kit Prinzip: nested-pcr, ORF 7, Amplifikat EU: 219 bps, US 336 bps Primer: Extern: PLR: 5 - TCG CCC TAA TTG AAT AGG TG -3 PLS: 5 - ATG GCC AGC CAG TCA ATC A 3 Intern: US-7-s: 5 - AGT CCA GAG GCA AGG GAC CG 3 US-7-as: 5 TCA ATC AGT GCC ATT CAC CAC 3 EU-7-s: 5 ATG ATA AAG TCC CAG CGC CAG 3 EU-7-as 5 CTG TAT GAG CAA CCG GCA GCA T 3 Bedingungen: Externe PCR: Titan One Tube RT PCR-System, RNasin RNase Inhibitor 45 o C 1 hr 94 o C 2 Min 30 Zyklen 94 o C 30 sec 58 o C 45 sec 68 o C 45 sec 68 o C 5 Min 4 o C unendlich Interne PCR: Qiagen Taq DNA Polymerase Kit 94 o C 5 Min 30 Zyklen 94 o C 1 Min 58 o C 1 Min 72 o C 1 Min 72 o C 5 Min 4 o C unendlich Andere von den teilnehmenden Laboren verwendete Protokolle sind publiziert in: Gilbert et al. 1997, Typing of porcine reproductive and respiratory syndrome viruses by a multiplex PCR assay, J. Clin. Microbiol.35, Egli et al., Quantitative TaqMan RT-PCR for the detection and differentiation of European and North American strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by RT-PCR amplification of whole viral genes. Vet. Microbiol. 64, Oleksiewicz et al., Sensitive detection and typing of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by RT-PCR amplification of whole viral genes. Vet. Microbiol. 64, Kono et al., Nested PCR for detection and typing of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in pigs. J Vet Med Sci. 58, Seite 3 -

4 Ergebnisse und Diskussion: Insgesamt stellten sich die Ergebnisse heterogen dar. Es wurden verschiedene Protokolle verwendet, von selbst etablierten PCR-Protokollen bis hin zu etablierten und seit vielen Jahren publizierten Verfahren. Ebenso wurde eine Vielzahl von Probenaufarbeitungs- Kits verwendet. Die Nachweisraten waren nicht homogen, wobei falsch negative Ergebnisse (geringe Sensitivität des Verfahrens) gegenüber falsch positiven Ergebnissen (mögliche Kontaminationen) deutlich überwogen. Eine Bewertung der Qualität der eingesetzten PCR-Protokolle ist nicht möglich, da die teilnehmenden Labors unterschiedliche Probenaufarbeitungsmethoden verwendet haben. Eine vergleichende, standardisierte Untersuchung dieser Methoden wäre sicherlich eine wichtige Aufgabe im Rahmen der molekularen (Tierseuchen-) Diagnostik. Dennoch lässt sich für den PCR-Nachweis und die Differenzierung US/EU-Genotyp aus den Ergebnissen der Trend ableiten, dass einige Protokolle eine höhere Erkennungsrate erbringen als andere. So benutzten die Labors A und D das Protokoll nach Pesch, während die meisten anderen Labors das Protokoll nach Gilbert verwendet haben. Ein Unterschied zwischen diesen Protokollen ist, dass die Primerauswahl auf unterschiedlichen Sequenzen beruht. Das aktuellere Protokoll nach Pesch verwendet Primer, die möglicherweise ein breiteres Spektrum an PRRSV-Isolaten binden als die der anderen Protokolle. Die hohe Evolutionsrate des PRRS-Virus macht es notwendig, die molekulare Diagnostik ständig zu validieren und gegebenenfalls anzupassen. Daher ist die regelmäßige Kontrolle der verwendeten Primer durch Vergleich mit neu publizierten Sequenzen in Genbank unbedingt notwendig. Die Darstellung der in diesem Ringtest verwendeten Protokolle soll es erlauben, die PRRSV-PCR in standardisierter Form durchzuführen, beziehungsweise bewährte Protokolle mit anderen zu vergleichen. Die regelmäßige Wiederholung eines Ringversuchs scheint aufgrund der Variabilität des Erregers und der großen wirtschaftlichen Bedeutung dieser Virusinfektion angezeigt. Es ist zu hoffen, dass sich auch in Zukunft Sponsoren finden, die diese wichtige Aufgabe unterstützen. Danksagung: Dieser Ringtest wurde durch die Firma Boehringer-Ingelheim finanziell unterstützt. - Seite 4 -

5 Verwendete Probenaufbereitung und PCR-Protokolle PCR Nachweis PRRS PCR-Differenzierung EU/US PCR-Differenzierung Feldvirus/Impfstamm Probenaufarbeitung eigene PCR ORF 7 eigene PCR ORF 1a RNeasy Mini Kit (organ); Viral RNA Mini Kit (serum) kommerzieller Kit (ORF 7) Quiagen RNA extraction kit Adiagene-Kit Quiagen RNA extraction kit Gilbert et al., 1997, ORF1b Pesch 2004; (mod) Christopher- Hennings 1995, ORF7 keine Angaben eigene PCR (Conzelmann 1993) ORF 1b eigene PCR (Conzelmann 1993) ORF 1b RNA-Isolierungs-Kit Biozym Egli et al., 2001(ORF 7) Egli et al., 2001(ORF 7) RNA-Isolierungs-Kit Biozym Gilbert et al., 1997, ORF1b Gilbert et al., 1997, ORF1b RNeasy Mini Kit (organ); Viral RNA Mini Kit (serum) Kono et al., 1996 (ORF 6 und 7) Kono et al., 1996 (ORF 6 und 7) keine Angaben Gilbert et al., 1997, ORF1b Gilbert et al., 1997, ORF1b RNeasy Mini Kit (organ) Gilbert et al., 1997, ORF1b Gilbert et al., 1997, ORF1b keine Angaben Eigene PCR (ORF 7) Eigene PCR (ORF 7) Eigene PCR (ORF 5) + DNA- Sequenzierung Rneasy (organ); High Pure viral RNA-Kit (serum) Oleksiewicz et al., 1998 (ORF 7) Oleksiewicz et al., 1998 (ORF 7) keine Angaben Gilbert et al., 1997, ORF1b Gilbert et al., 1997, ORF1b High Pure viral RNA-Kit (Roche) Gilbert et al., 1997, ORF1b Gilbert et al., 1997, ORF1b keine Angaben real-time, eigene PCR, ORF 7 real-time, eigene PCR, ORF 7 keine Angaben High Pure PCR Template Preparation Kit Gilbert et al., 1997, ORF1b Gilbert et al., 1997, ORF1b (Roche) - Seite 5 -

6 Ergebnisse: Grundpaket Labor Probenummer Probenart Probenidentität A B C D E F G H I J K L P G1 Serum pos, EU pos, EU pos pos pos, EU pos, EU pos pos, EU pos, EU pos, EU pos pos, EU pos pos, EU G2 Serum pos, EU pos, EU pos pos pos, EU pos, EU pos pos, EU pos, EU pos, EU pos pos, EU pos pos, EU G3 Serum pos, EU pos, EU pos pos pos, EU pos, EU pos pos, EU pos, EU pos, EU pos pos, EU pos pos, EU G4 Serum pos, EU pos, EU pos pos pos, EU pos, EU pos pos, EU pos, EU pos, EU pos pos, EU pos pos, EU G6 Serum pos, EU pos, EU pos pos pos, EU pos, EU neg pos, EU pos, EU pos, EU, US neg pos, EU pos pos, EU G7 Serum pos, EU pos, EU pos pos pos, EU pos, EU pos pos, EU pos, EU pos, EU pos pos, EU pos pos, EU G8 Serum pos, EU pos, EU pos pos pos, EU pos, EU neg neg pos, EU neg neg pos, EU pos pos, EU G9 Serum pos, EU pos, EU pos pos pos, EU pos, EU pos pos, EU pos, EU pos, EU pos pos, EU pos pos, EU G10 Organ pos, EU pos, EU pos pos pos, EU pos, EU neg pos, EU pos, EU pos, EU pos pos, EU pos pos, EU G11 Organ pos, EU pos, EU pos n.d. pos, EU neg neg pos, EU pos, EU pos, EU pos pos, EU pos pos, EU G12 Organ pos, EU pos, EU neg n.d. pos, EU neg neg neg neg pos, EU neg neg neg neg G13 Organ pos, EU pos, EU neg pos fraglich neg neg neg neg pos, US neg neg neg neg G16 Organ pos, US pos, US pos pos pos, US pos, US neg pos, US pos, US pos, US pos pos, US pos neg G17 Organ pos, US pos, US pos neg pos, US pos, US neg pos, US pos, US pos, US pos pos, US pos pos, US G18 Organ pos, US pos, US pos pos pos, US pos, US neg pos, US pos, US pos, US pos pos, US pos neg G19 Serum pos, US pos, US pos pos pos, US pos, US neg pos, US pos, US pos, US pos pos, US pos pos, US G20 Serum pos, US pos, US pos pos pos, US pos, US neg pos, US pos, US pos, EU, US pos pos, US pos neg G21 Serum neg neg n.d. n.d. neg neg neg neg neg neg neg neg neg pos, EU G22 Serum neg neg n.d. n.d. neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg G23 Serum neg neg neg n.d. neg neg neg neg neg pos, EU neg neg neg neg G24 Serum neg neg neg n.d. neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg G25 Organ neg neg n.d. n.d. neg neg neg neg neg pos, EU neg n.d. neg neg G26 Organ neg neg neg neg neg neg neg neg neg pos, EU neg neg neg neg G27 Organ neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg G28 Organ neg neg neg neg neg neg neg neg neg pos, EU neg neg neg neg G29 Organ neg neg neg neg neg neg neg neg neg pos, EU neg neg neg neg G30 Organ neg neg neg neg neg neg neg neg neg pos, EU pos neg neg neg G31 Serum pos, EU pos, EU neg n.d. pos, EU neg neg neg neg pos, EU neg neg neg pos, EU G32 Serum pos, EU pos, EU neg n.d. pos, EU neg neg neg neg pos, EU neg neg neg pos, EU - Seite 6 -

7 Ergebnisse: Differenzierungspaket I Labor Proben- Nr. Probenart Probenidentität A D G H I J K L M N O P 1.1. Serum pos, EU pos, EU pos, EU pos, EU pos, EU pos, EU neg pos, EU neg pos, EU pos, EU neg pos, EU 1.2. Serum pos, EU pos, EU pos, EU pos, EU pos, EU pos, EU pos, EU pos, EU pos, EU pos, EU pos, EU neg pos, EU 1.3. Organ pos, EU pos, EU neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg 1.4. Organ pos, EU pos, EU pos, EU neg neg pos, EU neg neg neg neg pos, EU pos, EU neg 1.5. Serum pos, EU, US pos, EU, US pos, EU, US pos, EU, US pos, EU, US pos, EU, US pos, US pos, EU, US pos, US pos, EU, US pos, EU, US pos, US pos, EU, US 1.6. Serum pos, EU, US pos, EU, US pos, EU, US pos, EU, US pos, EU, US pos, EU, US pos, US pos, EU, US pos, US pos, EU, US pos, EU, US pos, US pos, EU, US 1.7. Organ pos, EU, US pos, EU, US pos, US (EU) pos, EU, US pos, EU, US pos, EU neg pos, US pos, US pos, EU, US pos, EU, US pos, EU, US pos, EU 1.9. Organ pos, US pos, US pos, US neg pos, US neg pos, US pos, US pos, US neg pos, US pos, US neg Organ pos, US pos, US pos, US neg pos, US pos, EU neg neg pos, US neg neg neg neg Organ neg neg neg neg neg pos, EU neg neg neg neg neg neg neg Organ neg neg neg neg neg pos, EU pos, EU neg neg neg neg neg neg Organ neg neg pos, US neg neg pos, EU neg neg neg neg neg neg neg Serum pos, US pos, US neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg Serum neg neg neg neg neg pos, EU neg neg neg neg neg neg neg Serum neg neg neg neg neg pos, EU neg neg neg neg neg neg neg - Seite 7 -

8 Ergebnisse: Differenzierungspaket Probenummer Probenart Probenidentität A K 2.1. Serum pos, EU, Porc pos, EU, Porc pos, EU-Vakz 2.2. Serum pos, EU, Porc pos, EU, Porc pos, EU 2.3. Serum pos, EU pos, EU pos, EU 2.4. Serum pos, EU pos, EU pos, EU 2.6. Serum pos, EU, Porc pos, EU, Porc pos, EU-Vakz 2.8. Serum pos, EU, US pos, EU, US pos, EU, US Organ pos, US pos, US pos, US Serum neg neg neg Organ neg neg neg Organ neg neg neg Organ neg neg neg Organ neg neg neg Serum pos, EU, Porc pos, EU, Porc neg Serum pos, EU, Porc pos, EU neg Serum neg neg neg - Seite 8 -