Vorläufige Empfehlung des UAM zum Nachweis von SMRV in Zellinien Stand: Mai 2007

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1 Vorläufige Empfehlung des Unterausschuss Methodenentwicklung (UAM) der Bund/Länder-AG Gentechnik (LAG) zur Untersuchung von Zelllinien auf Kontamination mit dem Squirrel Monkey Retrovirus Aus der Überwachung gentechnischer Arbeiten in zwei Bundesländern wurden umfangreiche Kontaminationen von Vertebraten-Zelllinien mit dem Squirrel Monkey Retrovirus (SMRV) berichtet. Die Prüfung des Sachverhalts durch die Zentrale Kommission für die Biologische Sicherheit (ZKBS) hat Anlass zu der Befürchtung gegeben, dass der Austausch von Zellkulturen und Proben zwischen Laboren zu einer weiten Verbreitung der SMRV-Kontaminationen geführt haben kann. Aufgrund des breiten Wirtstropismus in vitro ist es derzeit nicht möglich, das Spektrum potenziell kontaminierter Zelllinien einzuschränken. Gemäß der beiliegenden Stellungnahme der ZKBS vom 07. Februar 2007, Az (vgl. Anlage 3), ist das SMRV der Risikogruppe 2 zugeordnet. Hieraus ergibt sich, dass gentechnische Arbeiten, bei denen SMRV-kontaminierte Zelllinien verwendet werden (insbesondere bei der Verwendung als Empfänger) ggf. der Sicherheitsstufe 2 (oder höher) zugeordnet werden können. Entsprechende gentechnische Arbeiten sind nur in gentechnischen Anlagen der Sicherheitsstufe 2 (oder höher) zulässig. Auf die einschlägigen Anmeldebzw. Genehmigungserfordernisse für gentechnische Anlagen und Arbeiten gem. 8 und 9 GenTG wird ausdrücklich verwiesen. In Übereinstimmung mit den Empfehlungen der ZKBS wird die Prüfung in gentechnischen Arbeiten verwendeter Zelllinien auf SMRV-Kontamination als dringend geboten erachtet. Der Unterausschuss Methodenentwicklung empfiehlt bis zum Vorliegen einer validierten Nachweismethode die Anwendung der folgenden Verfahrensanweisungen, die den sicheren PCR-basierten Nachweis von SMRV in Zelllinien und Kulturüberständen ermöglichen. Insbesondere für Projektleiter von gentechnischen Arbeiten mit Zelllinien, in denen keine Retroviren oder andere RNA-Viren verwendet werden, und die möglicherweise keine Erfahrung mit dem Nachweis von Retroviren haben, kann es hilfreich sein, eine klare Durchführungsvorschrift für die Überprüfung von Zelllinien auf SMRV zu erhalten. Die PCR zum Nachweis der SMRV-spezifischen Sequenzen sollte gemäß der als Anlage 1 beigefügten Arbeitsanweisung durchgeführt werden. Als geeignetes Referenzmaterial empfiehlt die Geschäftsstelle der ZKBS das Plasmid psmrv mit dem vollständigen Genom von SMRV (ATCC Nr ). Hierbei ist jedoch zu beachten, dass ATCC nur rekombinante E. coli mit dem Plasmid psmrv vertreibt. Dieser GVO (E. coli mit Volllängengenom von SMRV) ist in die Risikogruppe 2 einzustufen; der Umgang mit diesem GVO erfordert daher eine entsprechende gentechnikrechtliche Zustimmung (Sicherheitsstufe 2). Der Umgang mit der isolierten Plasmid-DNA oder mit PCR-Amplifikaten unterliegt hingegen nicht den Bestimmungen des Gentechnikrechts. Anlagen: 1. PCR zum Nachweis der SMRV-spezifischen Sequenzen: SMRV-Primer der AG Prof. Kalthoff und Dr. Röder mit aktualisiertem Temperaturprofil, sowie ß-Aktin-PCR mit Primern der AG Dr. Knippschild 2. Fließschema zur methodischen Vorgehensweise 3. Stellungnahme der ZKBS vom 07. Februar 2007 zur Einstufung von SMRV

2 Vorgeschlagene Vorgehensweise: Um den Aufwand der Überprüfung zu minimieren, wird ein abgestuftes Verfahren vorgeschlagen (vgl. Fließschema, Anlage 2): A) Um zu prüfen, ob die Zelllinie mit dem SMRV infiziert ist, sollte zunächst genomische DNA mit dem vorgeschlagenen PCR-Nachweis auf die SMRVspezifischen Genabschnitte gag und env analysiert werden. Hiermit wird die provirale DNA des Virus nachgewiesen. Die untersuchte Zelllinie kann als SMRVfrei betrachtet werden, wenn die Nachweise von gag und env in genomischer DNA der Zelllinien negativ waren und positive Ergebnisse mit den Kontrollen erhalten wurden. Ein positives Untersuchungsergebnis für die viralen Genabschnitte gag oder env ist als Nachweis einer Infektion der Zelllinie mit SMRV zu werten und es sind somit entsprechende Maßnahmen zu ergreifen. B) Bei einem für SMRV-gag und SMRV-env positiven Ergebnis ist zu prüfen, ob die Virusgene transkribiert werden und ob Viren von der Zelllinie freigesetzt werden. Beide Untersuchungen können parallel durchgeführt werden. Nachgewiesen wird die virale RNA. Es wird empfohlen als Positiv-Kontrolle den Nachweis eines in der betreffenden Zelllinie (Spezies) konstitutiv exprimierten Referenzgens (z.b. ß-Aktin) durchzuführen. Damit können alle Verfahrensschritte (Nukleinsäureisolierung und PCR-Nachweis) abgesichert werden. Zu A) Für die Isolierung der Nukleinsäuren können handelsübliche Kits (z.b. DNeasy Blood & Tissue Kit, Fa. Qiagen) für die DNA-Isolierung verwendet werden. Mit der isolierten DNA sowie dem vorgeschlagenen Referenzmaterial als Positiv-Kontrolle werden die PCR-Nachweise durchgeführt. Zu B) Für den Nachweis des SMRV ist die Isolierung des RNA-Genoms aus dem Zellkulturüberstand erforderlich. Dies kann mit einem handelsüblichen Kit (z.b. QIAamp Viral RNA Mini Kit für RNA-Isolierung, Fa. Qiagen) erfolgen. Aus der isolierten RNA wird eine cdna hergestellt. Mit dieser können die angegeben PCR-Nachweise durchgeführt werden. Anmerkung: Es bietet sich an, RNA aus der Zelllinie und dem Überstand parallel zu isolieren. Durch den Nachweis eines konstitutiv exprimierten Referenzgens mit der RNA (cdna) aus der Zelllinie kann der Erfolg der RNA-Isolierung und cdna-synthese überprüft werden. Die Isolierung von RNA aus der Zelllinie und dem Kulturüberstand kann meist mit dem gleichen kommerziell erhältlichen Kit, der für die Isolierung viraler RNA vorgesehen ist (z.b. QIAamp Viral RNA Mini Kit für RNA-Isolierung, Fa. Qiagen) oder einem Kit der für DNA und virale RNA geeignet ist, erfolgen. Statt des Zellkulturüberstands wird dann eine geringe Anzahl von Zellen eingesetzt. Um eine Kontamination der isolierten RNA durch DNA auszuschließen (falsch positive Ergebnisse), ist ein Verdau mit RNAse-freier DNase erforderlich. Die Synthese der cdna aus der isolierten RNA kann entweder gesondert, oder in einem Schritt mit dem PCR- Nachweis mit einem one tube RT-PCR-Kit (z.b. Qiagen OneStep RT-PCR Kit) erfolgen.

3 Anlage 1 PCR zum Nachweis der SMRV-spezifischen Sequenzen (SMRV-Primer der AG Prof. Kalthoff und Dr. Röder, aktualisiertes Temperaturprofil) Für die Erstellung der SMRV-H spezifischen Primer wurde die GENBANK-Sequenz M23385 verwendet. A. SMRV-PCR-Nachweis: env: Primer forw. env: 5 GGC GGA CCC CAA GAT GCT GTG 3 TM = 63,2 C Primer rev. env: 5 TGG GCT AGG CTG GGG TTG GAG ATA 3 TM = 63,4 C PCR-Produkt: 197 bp gag: Primer forw gag: 5 TCA GAG CCC ACC GAG CCT ACC TAC 3 TM = 61,5 C Primer rev gag: 5 CAG CGC AGC ACG AGA CAA GAA AA 3 TM = 61,3 C PCR-Produkt: 186 bp Temperatur-Zeit-Programm gag und pol: Temperaturschritt T ( C) Zeit (sec) Anzahl Zyklen UNG (nur falls eingesetzt) x Aktivierung (nur falls Hot-Start-Enzym einges.) initiale Denaturierung x Amplifikation Denaturierung Annealing x Elongation Anmerkung: Die Annealing-Temperatur sollte für den SMRV-env-Nachweis nicht unter 65 C liegen, da sonst unspezifische Amplifikate auftreten können. B. Kontroll-PCR-Reaktion: ß-Aktin (Primer der AG Dr. Knippschild) Primer 281 (forw.): 5 GGC ATC CTC ACC CTG AAG TA 3 TM = 51,4 C Primer 282 (rev.): 5 GTC AGG CAG CTC GTA GCT CT 3 TM = 54,3 C PCR-Produkt mit genomischer DNA: ca bp Anmerkung: Diese Primer sollten für Zelllinien von Homo sapiens und weitere Spezies verwendbar sein. Bei negativem Ergebnis ist zu prüfen, ob diese Primer für die untersuchte Spezies geeignet sind. Temperatur-Zeit-Programm ß-Aktin: Temperaturschritt T ( C) Zeit (sec) Anzahl Zyklen UNG (nur falls eingesetzt) x Aktivierung (nur falls Hot-Start-Enzym einges.) initiale Denaturierung x Amplifikation Denaturierung Annealing x Elongation 72 60

4 PCR-Ansatz: Reagenz Arbeitskonzentration Volumen pro Reaktion (µl) Mastermix (enthält Puffer, 2x 12,5 dntp, Polymerase) Primer forw. 10 µmol/l 0,5 Primer rev. 10 µmol/l 0,5 DNA (Probe) 5 ng/µl -20 ng/µl 5 H 2 O 6,5 Gesamtes Reaktionsvolumen -/- 25 Anmerkung: Die Endkonzentration der Primer in der PCR-Reaktion beträgt jeweils 200 nmol/l. Um die Spezifität der PCR zu erhöhen, sollte eine Hot-Start-Polymerase eingesetzt werden.

5 Anlage 2:

6 Anlage 3: Stellungnahme der ZKBS zur Kontamination von Zelllinien mit dem Squirrel Monkey Retrovirus Az vom 7. Februar 2007 Vor kurzer Zeit wurden von zwei zusammenarbeitenden deutschen Laboratorien umfangreiche Kontaminationen ihrer Zellkulturbestände mit dem Squirrel Monkey Retrovirus (SMRV) bei den zuständigen Landesbehörden, dem Ministerium für Landwirtschaft, Umwelt und ländliche Räume des Landes Schleswig-Holstein und dem Regierungspräsidium Tübingen gemeldet. Die Kontaminationen wurden zufällig bei Expressionsanalysen von rekombinanten Zelllinien entdeckt. Die Überprüfung der vorhandenen Zellkulturbestände ergab, dass die SMRV-Kontamination bereits seit mehreren Jahren vorhanden ist und wahrscheinlich durch Verschleppung während der Labortätigkeiten von einer Zelllinie zur Nächsten übertragen wurde. 1 Durch Weitergabe von Probenmaterial und Zellkulturen an Kooperationspartner ist eine weitere Verbreitung der Kontamination wahrscheinlich. Bereits 1982 wurden SMRV- Kontaminationen in verschiedenen Vertrebraten-Zelllinien beschrieben. 2 Aus der Burkitt- Lymphom-Zelllinie Namalwa, die kommerziell für die Herstellung von α-interfon verwendet wurde, konnte 1998 ein humanes Isolat des SMRV (SMRV-H) nachgewiesen werden. In 39 von 75 getesteten käuflichen Interferonpräparaten von verschiedenen Herstellern aus verschiedenen Ländern konnten SMRV-Sequenzen nachgewiesen werden. 3 Die zuständigen Landesbehörden bitten die ZKBS um eine Risikobewertung des SMRV und um eine Empfehlung für den weiteren Umgang mit Zellkulturen bei gentechnischen Arbeiten. Bewertung Risikobewertung des SMRV Das SMRV ist ein 1977 aus dem Lungengewebe eines Totenkopfaffen (Saimiri sciureus) isoliertes endogenes Typ D Retrovirus, das nach der aktuellen Klassifikation durch das International Committee on Classification of Viruses der Gattung Betaretrovirus zugeordnet wurde. 4 Es weist Homologien zu Typ A, Typ B und Typ C Retroviren auf. 5 Natürliche Infektionen anderer Wirte sind nicht beschrieben. Aufgrund der Kontamination von zahlreichen Vertebraten-Zelllinien (vom Mensch, Hund, Nerz, Alt- und Neuweltaffe) verfügt es in vitro über einen breiten Wirtstropismus. 5, 6 Es gibt keinen Hinweis auf Pathogenität von SMRV für seinen natürlichen Wirt, den nichthumanen Primaten. Infektionen oder Erkrankungen bei Personen, die mit den SMRVkontaminierten Interferonpräparaten behandelt wurden, sind nicht beschrieben. Eine geringe Pathogenität des SMRV ist nicht auszuschliessen, da in der Zelllinie Namalwa nachgewiesen werden konnte, dass ein unvollständiges SMRV-H provirales Genom in den Locus des Proto-Onkogenes c-myc inserierte. 7 Aufgrund des breiten Wirtstropismus und der Möglichkeit in Einzelfällen durch Insertionsmutagenese die Aktivierung zellulärer Onkogene oder die Änderung der Transkriptionsaktivität anderer regulatorischer Gene zu induzieren, kann ein geringes Gefährdungspotenzial von SMRV nicht ausgeschlossen werden. In den Richtlinien der Schweiz (BUWAL) und im Merkblatt B004 der BG Chemie wird SMRV als tierpathogener Organismus in der Risikogruppe 2 geführt und die ATCC empfiehlt BSL 2. Die ZKBS ordnet ebenso das SMRV gemäß 5 Absatz 1 GenTSV i.v.m. den Kriterien im nhang I GenTSV als Spender- und Empfängerorganismus für gentechnische Arbeiten in die Risikogruppe 2 ein. Empfehlung für den weiteren Umgang mit Zellkulturen bei gentechnischen Arbeiten Die ZKBS schließt die Möglichkeit einer verbreiteten Kontamination von Zelllinien mit SMRV nicht aus. Sie empfiehlt daher, Zelllinien, die bei gentechnischen Arbeiten verwendet werden, auf SMRV zu prüfen. Kontaminierte Zelllinien sollten inaktiviert werden oder unter

7 Sicherheitsmaßnahmen der Stufe 2 gehalten werden. Außerdem weist die ZKBS darauf hin, dass eine Komplementierung rekombinanter replikationsdefekter Retroviren in Zelllinien, die mit SMRV kontaminiert sind, nicht ausgeschlossen werden kann. Auch Tiere, auf die Zellen oder deren Überstände übertragen wurden, sind möglicherweise mit SMRV infiziert und sollten ebenso überprüft oder unter Sicherheitsmaßnahmen der Stufe 2 gehalten werden. Es wird gebeten, Ergebnisse zu SMRV getesteten Zelllinien und über Komplementierungen rekombinanter replikationsdefekter Retroviren an die ZKBS zu übermitteln. Hinweise: Auf die allgemeine Stellungnahme der ZKBS zu häufig durchgeführten gentechnischen Arbeiten mit den zugrunde liegenden Kriterien der Vergleichbarkeit: Gentransfer mit Hilfe retroviraler Vektoren, Az , vom Juni 1996, wird hingewiesen. Nachfolgende Sequenzen sind geeignet für den PCR-Nachweis von SMRV: env: Upper Primer: GGCGGACCCCAAGATGCTGTG Lower Primer: TGGGCTAGGCTGGGGTTGGAGATA gag: Upper Primer: TCAGAGCCCACCGAGCCTACCTAC Lower Primer: CAGCGCAGCACGAGACAAGAAAA Literatur 1. A C van der Kuyl, R Mang, J T Dekker, and J Goudsmit. Complete nucleotide sequence of simian endogenous type D retrovirus with intact genome organization: evidence for ancestry to simian retrovirus and baboon endogenous virus. J Virol May; 71(5): Popovic M et al. Identification of the RPMI 8226 retrovirus and its dissemination as a significant contaminant of some widely used human and marmoset cell lines. Int J Cancer Jul 15;30(1): Pienkowska M, Seth A. Detection of squirrel monkey retroviral sequences in interferon samples. J Hepatol Mar;28(3): RL Heberling, ST Barker, SS Kalter, GC Smith, and RJ Helmke. Oncornavirus: isolation from a squirrel monkey (Saimiri sciureus) lung culture. Science 21 January 1977:Vol no. 4275, pp Chiu Cindy N, Mitra R ; Chiu Ing-Ming. Exchange of genetic sequences of long terminal repeat and the env gene by a promiscuous primate type D retrovirus. Virus res. 2003, vol. 96, no.1-2, pp Ikeda S. ; Tsutsui K. ; Hatsushika M. ; Watanabe S. ; Oda T. Purification and biochemical characterization of squirrel monkey retrovirus-h produced in a human lymphoblastoid cell line. 1992, vol. 38, no 5-6, pp Middleton PG; Miller S; Ross JA; Steel CM; Guy K. Insertion of SMRV-H viral DNA at the c-myc gene locus of a BL cell line and presence in established cell lines. Int J Cancer Sep 30;52(3):451-4