kanr camr F trad36, lac I q lacz M15 proab/supe thi (lac-proab), λimm434 (P1)
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- Angelika Kramer
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1 Material Material 2.1 Tierstämme CD-1(ICR)BR, Auszucht-Maus Dll1-Knockout-Mäuse Hühnereier, Gallus gallus Charles River, Deutschland GSF, München Geflügelanstalt, Kitzingen Brüterei Mahler, Rimpar 2.2 Bakterienstämme DH5α supe44, DlacU169 (f80laczdm15), hsdr17, reca1, enda1, gyra96, thi-1, rela1 ER1647 tet R, str R F, λ, trp-31, his-1, rspl104 (StrR), fhua 2 (lacz)r1, supe44, xyl-7, mtl-2, metb1, recd 1014, mcra 1272::Tn10, (mcrb - hsdrms - mrr)2::tn10 BM25.8 kanr camr F trad36, lac I q lacz M15 proab/supe thi (lac-proab), λimm434 (P1) 2.3 cdna-bibliotheken und Hybrid-DNA-Panel 8,5 Tage embryonale Maus cdna-bibliothek Brigid Hogan (Fahrner et al., 1987) 11 Tage embryonale Maus cdna-bibliothek Novagen, Madison, WI in λshlox TM Vektor Genebridge Radiation Hybrid Panel (GB4) Mouse Backcross Panel EUCIB HGMP Resource Center, Cambridge HGMP Resource Center, Cambridge 2.4 Plasmid-Vektoren Klonierungsvektoren pbluescript II KS (+) pshlox pgex-1t Stratagene, La Jolla, CA Novagen, Madison, WI Vektoren zur Proteinexpression pgex-hey1 pgex-e12 MscI-Fragment der Hey1-cDNA enthält bhlh- und Orange-Domänen in pgex-1t/smai E12-cDNA in pgex
2 Material 13 pgex-myf5 pt7βsal-e2-2 pt7βsal-e2-5 pt7βsal-myf5 pcs2+mmyod Myf5-cDNA in pgex E2-2-cDNA in pt7βsal E2-5-cDNA in pt7βsal Myf5-cDNA in pt7βsal MyoD-cDNA in pcs2+ E12pII bhlh-teil der E12-cDNA in pcs2+ Die Vektoren pgex-e12 und pgex-myf5 für die Proteinexpression in E. coli wurden von Thomas Braun (Halle), die Vektoren für die Proteinexpression im Retikulozytenlysat von Thomas Braun (pt7βsal-e2-2, pt7βsal-e2-5, pt7βsal-myf5) und Ralph Schreck, Würzburg (pcs2+mmyod, E12pII) zur Verfügung gestellt. Vektoren zur Herstellung von Hybridisierungsproben pcpax3 Maus Pax3-cDNA in pbluescript (T. Braun) c-hairy1 3 Bereich der c-hairy1 cdna in pbluescript (O. Pourquiér) 2.5 I.M.A.G.E.-Klone Alle I.M.A.G.E.-Klone wurden vom Resourcen Zentrum in Berlin zur Verfügung gestellt. 2.6 Oligonukleotide Alle Oligonukleotide wurden von der Firma MWG Biotech GmbH (Ebersberg) bezogen. Primer zur Differential Display PCR-Analyse (nach Linskens et al., 1995) oligo-dt-primer A B C D E F G H J K L M GCG CAA GCT TTT TTT TTT TTC T GCG CAA GCT TTT TTT TTT TTC C GCG CAA GCT TTT TTT TTT TTC G GCG CAA GCT TTT TTT TTT TTG T GCG CAA GCT TTT TTT TTT TTG G GCG CAA GCT TTT TTT TTT TTG A GCG CAA GCT TTT TTT TTT TTA T GCG CAA GCT TTT TTT TTT TTA C GCG CAA GCT TTT TTT TTT TTA G GCG CAA GCT TTT TTT TTT TTA A GCG CAA GCT TTT TTT TTT TTC A GCG CAA GCT TTT TTT TTT TTG C 5 -arbitrary-primer 00 CGG GAA GCT TAT CGA CTC CAA G 01 CGG GAA GCT TTA GCT AGC ATG G
3 Material CGG GAA GCT TGC TAA GAC TAG C 03 CGG GAA GCT TTG CAG TGT GTG A 04 CGG GAA GCT TGT GAC CAT TGC A 05 CGG GAA GCT TGT CTG CTA GGT A 06 CGG GAA GCT TGC ATG GTA GTC T 07 CGG GAA GCT TGT GTT GCA CCA T 08 CGG GAA GCT TAG ACG CTA GTG T 09 CGG GAA GCT TTA GCT AGC AGA C 10 CGG GAA GCT TCA TGA TGC TAC C 11 CGG GAA GCT TAC TCC ATG ACT C 12 CGG GAA GCT TAT TAC AAC GAG G 13 CGG GAA GCT TAT TGG ATT GGT C 14 CGG GAA GCT TAT CTT TCT ACC C 15 CGG GAA GCT TAT TTT TGG CTC C 16 CGG GAA GCT TTA TCG ATA CAG G 17 CGG GAA GCT TTA TGG TAA AGG G 18 CGG GAA GCT TTA TCG GTC ATA G 19 CGG GAA GCT TTA GGT ACT AAG G Sequenzierprimer für Hey1 Clk1 AGTGCCTTTGAGAAGCAGGG Clk2 CTGGCCAAAACCTGGGAC Clk3 TCCCCAGGGAATGTGTCC Clk4 CGCTGAGGCAAACGGAAT Clk5 TGGGGACCTAGACTACCAGC Clk6 CCACCCTAAAGTCGCCAGTA Sequenzierprimer für C0-5 Cews1 TGGCGGGCCTCTAATCCTC Cews3 CCTTGCATATCTGCAGGGC Cews4 CTGGGGGTGATGATCGGGT Primer zur Kartierung des humanen Hey1-Gens Cest-a CCAGTTCAGTGGAGGTCGTT Cest-b GTTTTCCTTTTGGTGCATGG Oligonukleotid-Paare für DNA-Bindungsstudien E-Box (B): Ebox-t GATCCAGGTCACGTGGCCTG Ebox-b AATTCAGGCCACGTGACCTG µe5: µe5-t CTAGAGAACACCTGCAGCAGCTGGCAGG µe5-b CTAGCCTGCCAGCTGCTGCAGGTGTTCT MCK: MyoD-t GATCCCCCCAACACCTGCTGCCTGA
4 Material 15 MyoD-b CTAGTCAGGCAGCAGGTGTTGGGGG N-Box: Nbox-t CTAGACGCCACGAGCCACAAGGATTG Nbox-b CTAGCAATCCTTGTGGCTCGTGGCGT 2.7 Gewebekultur-Medien und Seren Leibowitz L15 mit GlutaMaxI DMEM/F12 1:1 mit GlutaMaxI Fötales Kälberserum Lammserum Biochrom (Berlin) oder PAA (Cölbe) 2.8 Pufferlösungen Alle nicht gesondert aufgeführten Pufferlösungen wurden nach Sambrook (1989) oder Ausubel ( ) hergestellt. 2.9 Enzyme und Kits Alle in dieser Arbeit verwendeten und nicht gesondert aufgeführten Enzyme und Kits wurden von folgenden Firmen bezogen: MBI, St. Leon-Rot; ; Sigma, Deisenhofen; Qiagen, Hilden; Macherey-Nagel, Düren; Clontech, Palo Alto, USA; Eurogentec, Seraing, Belgien. Produkte für die in situ Hybridisierung stammen im wesentlichen von Boehringer Mannheim (Roche Molecular Biochemicals). Pwo DNA-Polymerase SequiTherm Cycle Sequencing-Kit SuperScript II Reverse Transcriptase Taq DNA-Polymerase Thermo Sequenase Radiolabeled Terminator Cycle Sequencing Kit TNT T7/Sp6 Coupled Reticulocyte Lysate System TRIzol Reagens AGS, Heidelberg Biozym,Hess. Oldendorf Promega, Madison, WI 2.10 Chemikalien Alle nicht gesondert aufgeführten Chemikalien zum Ansetzen von Puffern, Medien und Reaktionslösungen wurden von Roth GmbH, Karlsruhe; Sigma GmbH, Deisenhofen; GibcoBRL, Eggenstein oder Merck, Darmstadt bezogen.
5 Material 16 γ 32 P-ATP (3000 Ci/mmol) α 32 P-dCTP (3000 Ci/mmol) Hartmann Analytics, Braunschweig Hartmann Analytics, Braunschweig 35 S-Methionin (1000 Ci/mmol) Amplify CHAPS dntps Glutathion-Sepharose Boehringer, Mannheim 2.11 Software Bildverarbeitung: Phosphor-Imager: Textverarbeitung: Sequenzdatenvergleich: Adobe-Photoshop; Micrografx Designer ImageQuant Microsoft Office, EndNote Wisconsin Package, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin NCBI Blast
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Merck Biosciences, Darmstadt. Thermo Hybaid GmbH, Ulm Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
3 Materialien 28 3 Materialien 3.1 Chemikalien Acrylamid Agar Agarose Ammoniumsulfat Ampicillin, Natriumsalz L-Arabinose Bradford-Reagenz Bromphenolblau Caseinhydrolysat Chloramphenicol Chloroform Coomassie-Brillant-Blau
A- Zugabe von 180µl Pufferlösung und Proteinase K, Inkubation bei 56 C. B- Zugabe von 200µl einer zweiten Pufferlösung, Inkubation bei 70 C
3 Methoden 3.1 Extraktion der DNA aus den Paraffinschnitten 3.1.1 Extraktions-Kit Das QIAamp DNA Mini Kit- System beruht auf dem Prinzip der Auflösung der Eiweiße mit Proteinase K, DNA Bindung an eine
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3 Material 3.1 Reagenzien Tabelle 1: verwendete Reagenzien Substrat Hersteller Firmensitz Agarose (NEEO, Ultra-Qualität) Carl Roth Karlsruhe BPB (Bromphenolblau) Merck Darmstadt DEPC (Diethylpyrocarbonat)
TCC CCA GTG AAG ACC TCC TCA GAG TCC GAC TCT. 56 C 67 siehe oben siehe oben siehe oben 56 C 66 CCG GCG CCA TTC TAT CC CGA GAA TCT GAC GCA GG 56 C 738
128 9. Anhang 9.1. Tabelle der verwendeten Primerpaare Nr. Name Sequenz 5 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 rcar. 981s rcar. 981s GAPDH. 682s GAPDH. 826a GAPDH. 381s GAPDH. 826a 18S-rRNA. 216s 18S-rRNA.
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