Differenzielle Expression von Glomus intraradices Genen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien der arbuskulären Mykorrhiza

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1 Differenzielle Expression von Glomus intraradices Genen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien der arbuskulären Mykorrhiza I n a u g u r a l d i s s e r t a t i o n zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald vorgelegt von Katja Watzke geboren am in Wolfen Greifswald,

2 Dekan: Prof. Dr. Klaus Fesser 1. Gutachter: Prof. Dr. Rüdiger Bode 2. Gutachter: Prof. Dr. François Buscot Tag der Promotion:

3 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung Die Mykorrhiza Symbiose: Ein Geben und Nehmen Evolutionäre Aspekte Besonderheiten der arbuskulären Mykorrhizapilze Lebenszyklus der AM-Pilze Phylogenie der Glomeromycota speziell von G. intraradices Morphologie von G. intraradices Sporen-Morphologie Extra- und intrazelluläre Strukturen Taxonomische Bestimmung von AM-Pilzen Morphologische Untersuchungen von AM-Pilzen Molekularbiologische Untersuchungen von AM-Pilzen In vitro Kultur von AM-Pilzen und bisher verwendete Wirtspflanzen Bisher identifizierte und charakterisierte AM-Pilz-Gene Zielsetzung Materialien und Methoden Materialien Geräte Chemikalien Oligonukleotidprimer Enzyme Kit Systeme Medien, Puffer und Färbelösungen Pilz-, Pflanzen-, Bakterienstämme/-arten und kommerzielle Mykorrhiza-Präparate Methoden Sporenisolation aus Blähton Sporensterilisation Herstellung einer transfizierten Daucus carota (Karotte) Wurzelkultur [79] Herstellung einer transfizierten Fragaria x Ananassa (Duch.) (Erdbeere) Wurzelkultur [48]

4 Inhaltsverzeichnis Herstellung einer transfizierten Helianthus annuus L. (Sonnenblume) Wurzelkultur In vivo-test der in vitro produzierten Sporen Wurzelfärbung, Färbung der Sporenkerne und Vitalitätstest für Sporen Wurzelfärbung Färbung der Sporen-Kerne Vitalitätstest DNA-Isolation aus Einzelsporen, Sporengruppen und Wurzeln DNA -Isolation aus Einzelsporen DNA -Isolation aus Sporengruppen (in vitro Sporen) DNA -Isolation aus der Wurzel (mittels Qiagen DNeasy Plant Mini Kit) Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Generierung und Isolation von asymbiotischem und symbiotischem Pilzmaterial Symbiotisches Pilzmaterial Asymbiotisches Pilzmaterial RNA-Isolation aus Wurzeln und/oder Sporen und Hyphen cdna-synthese aus asymbiotischem und symbiotischem Material Subtraktive Hybridisierung SSH (suppression subtractive hybridization) RsaI-Verdau der SMART-cDNA s Aufreinigung der geschnittenen cdna s Adaptorligation und Ligationseffizensanalyse Durchführung der subtraktiven Hybridisierung (Abb. 2.6) Suppressions-PCR Erstellung der cdna-banken Ligation und Transformation mittels TOPO TA Kloning Kit Plasmidisolation und Sequenzierung der erhaltenen Klone Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR) Filterhybridisierungs-Test Isolation von full-length ORF s bzw. Genen Walker-Restriktion-Ligation-PCR TOPO-Walker Kit Degenerierte Primer Ergebnisse

5 Inhaltsverzeichnis 3.1 Molekularbiologische Einordnung des verwendeten G. intraradices Stammes und Abgrenzung von anderen kommerziellen Produkten Etablierung der G. intraradices in vitro Kultur Test der in vitro Sporen Vitalitätstest Molekularbiologische Untersuchung der einzelnen Passagen Färbung der Sporenkerne (Nachweis der Vielkernigkeit) In vivo Test der in vitro produzierten Sporen Erstellung der asymbiotischen und symbiotischen cdna Bank Erstellung zweier subtraktiver cdna-banken Datenbankvergleich und Identifikation putativer Gene Expressionsanalyse der asymbiotischen und symbiotischen cdna s Filterhybridisierungs-Test Isolation von full-length ORF s bzw. Gene Vergleich des Sporulationspotentials der neu etablierten in vitro Systeme Test der neu etablierten in vitro Systeme mit Hilfe der neu isolierten Markergene Test der neu isolierten Markergene im Gewächshausversuch Diskussion Molekularbiologische Einordnung des AMykor G. intraradices Stammes/Isolates Färbung von Mykorrhizapilz-Strukturen und Vitalitätstest Etablierung der AMykor in vitro Kultur und Herstellung neuer Wurzellinien Isolation von differentiell exprimierten G. intraradices Genen Zusammenfassung Veröffentlichungen Literatur Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Anhang...39 Danksagung...39 Lebenslauf...39 Erklärung

6 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung AM arbuskuläre Mykorrhiza AM-Pilze arbuskuläre Mykorrhizapilze Aqua dest. destilliertes Wasser AUS Australien BEG La Banque Européene des Glomales (European Bank of Glomales) Bp Basenpaar(e) DNA Desoxyribonukleinsäure (deoxyribonucleic acid) dntp Desoxynukleosidtriphosphat EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ERM extraradikales Myzel EST Expressed Sequence Tags etc. et cetera G. clarum Glomus clarum G. intraradices Glomus intraradices G. mosseae Glomus mosseae INVAM International Culture Collection of Arbuscular & Vesicular- Mykorrhizal Fungi IRM intraradikales Myzel LSU große Untereinheit (large subunit) M molar, Molarität (mol/l) mg Milligramm ml Milliliter mm millimolar µg Mikrogramm µl Mikroliter µm mikromolar µm Mikrometer NCBI National Center for Biotechnology Information ORF Open Reading Frame PCR Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction) 4

7 Abkürzungsverzeichnis PVLG rdna RNase Sporenbez. SSU Tab. Taq TB-Puffer TE-Puffer Tris U US-TX WT w/v z.b. Polyvinyl alcohol-lactic acid-glycerol ribosomale DNA Ribonuklease Sporenbezeichnung kleine Untereinheit (small subunit) Tabelle Thermus aquaticus Tris-Borat-EDTA-Puffer Tris-EDTA-Puffer Tris(hydroxymethyl)aminomethan Unit(s) USA-Texas Wildtyp Masse pro Volumen (weight per volume) zum Beispiel 5

8 1. Einleitung 1. Einleitung 1.1 Die Mykorrhiza Das Wort Mykorrhiza stammt aus dem Griechischen myces, der Pilz und rhiza, die Wurzel und wurde 1885 von dem Berliner Forstbotaniker A.B. FRANK [1] eingeführt. Mykorrhiza bezeichnet die Lebensgemeinschaft zwischen Pilzen und den Wurzeln höherer Pflanzen. Mit der Symbiose geht stets eine starke Anpassung beider Partner einher, so dass die Symbionten getrennt kaum optimal existieren können Symbiose: Ein Geben und Nehmen Pflanzen brauchen eine Reihe von Nährstoffen, welche sie aus dem Boden aufnehmen. Die größte Bedeutung kommt dabei den Elementen Phosphor und Stickstoff zu. Im Pflanzengewebe ist Stickstoff in zehnfach höherer Konzentration eingebaut als Phosphor, dementsprechend mehr benötigt die Pflanze. In vielen Böden ist allerdings genügend Stickstoff vorhanden und die Pflanze ist auch in der Lage diesen aufzunehmen. Phosphor kann von der Pflanze hingegen nur schwer aus dem Boden aufgenommen werden, da er in Form von schwerlöslichen Mineralien vorliegt und schnell zum limitierenden Faktor für die Pflanzenentwicklung wird [2]. An dieser Stelle können die heterotrophen arbuskulären Mykorrhizapilze Abhilfe schaffen; sie versorgen die Pflanze mit Phosphaten. Durch die Bildung eines Hyphennetzes um die Wurzel vergrößern sie den Einzugsbereich der Pflanzen für diese Nährstoffe. Pilzhyphen können wegen ihres geringen Durchmessers den Boden schneller und dichter besiedeln als Pflanzenwurzeln und erhöhen somit die absorbierende Oberfläche [3]. Außerdem ist es den AM-Pilzen durch Vergesellschaftung mit Bodenbakterien möglich, schwerlösliche Phosphatmineralien aufzulösen. Die Pflanze versorgt im Gegenzug dazu den Pilz mit Kohlenhydraten aus der Photosynthese. Die Ernährung ist nicht der einzige wichtige Aspekt dieser Symbiose. Der AM-Pilz beeinflusst auch die Abwehrreaktion der Pflanze gegen pathogene Pilze [4-6] und ist durch die Produktion von Phytohormonen in der Lage, in die Physiologie und das Wachstum der Pflanze einzugreifen [7, 8]. Des Weiteren kann der Pilz die Pflanze vor schädlichen 6

9 1. Einleitung Umwelteinflüssen (abiotische Faktoren), wie Trockenheit [9, 10] oder Schwermetallen schützen [11, 12] Evolutionäre Aspekte Die arbuskuläre Mykorrhiza ist eine der ältesten Symbiosen, welche Pflanzen eingehen. Die heute lebenden terrestrischen Pflanzen sind sehr gut an das Leben an Land angepasst, doch die ersten moosähnlichen Pflanzen, die begannen das Festland der Erde zu besiedeln, stießen auf harte und unwirtliche Umweltbedingungen. Auf Grund von Fossilien kann heute belegt werden, dass es den ersten Landpflanzen mit Hilfe dieser Symbiose möglich war, den neuen Lebensraum zu besiedeln. Man spricht von einer Co-Evolution von Pflanzen und arbuskulären Mykorrhizapilzen vor ungefähr 450 Millionen Jahren (Abb. 1.1). Diese Co- Evolution erklärt die nahezu ubiquitäre Verbreitung der AM-Symbiose im Pflanzenreich, sowie im gesamten Ökosystem. Es wird angenommen, dass arbuskuläre Mykorrhizapilze (AM-Pilze) bereits seit 900 oder gar 1200 Millionen Jahren existieren und damit wesentlich älter als die Landpflanzen sind. Wahrscheinlich bildeten sie damals eine Symbiose mit Cyanobakterien. Solche Symbiosen existieren auch heute noch unter den Geosiphon-Arten. Ursprung der AM-Pilze Landpflanzen Monokotyle/ Dikotyle Pflanzen KAMBRIUM ORDOVIZIUM SILUR DEVON KARBON PERM TRIAS JURA KREIDE TERTIÄR Heute Millionen Jahre Abb. 1.1: Co-Evolution von Pflanzen und AM-Pilzen vor ungefähr 450 Millionen Jahren [13] Besonderheiten der arbuskulären Mykorrhizapilze AM-Pilze sind obligat biotrophe Organismen; sie können nur in Anwesenheit eines pflanzlichen Symbiosepartners leben. Sie bilden keine makroskopischen Strukturen und sind nicht pathogen. Die AM-Pilze leben versteckt und unscheinbar im Boden [14]. Sie vermehren sich wahrscheinlich nur asexuell über die Bildung von vielkernigen Sporen. Es wird 7

10 1. Einleitung angenommen, dass die einzelnen Sporen eine uniforme Anzahl von Kernen enthalten, welche eine Anzahl von intranuklearen Polymorphismen aufweisen. AM-Pilze spielen eine entscheidende Rolle in der Ökologie und Physiologie von Landpflanzen. Sie helfen Pflanzen im Umgang mit biotischem (z.b. Infektion mit Krankheitserregern) und abiotischem (z.b. Nährstoff- oder Wassermangel) Stress. Heute leben bis zu 80 % der Landpflanzen, einschließlich Angiospermae, Gymnospermae, Pteridophta und Moose in dieser uralten Symbiose zusammen mit AM-Pilzen. Nur einige Arten unter den Brassicaceae, Caryophyllaceae, Chenopodiaceae und den Urticaceae bilden keine AM-Symbiose aus [15] Lebenszyklus der AM-Pilze Der Lebenszyklus der AM-Pilze (Abb. 1.2) beginnt mit der Keimung einer Pilzspore. Ohne einen pflanzlichen Symbiosepartner zeigen AM-Pilze nur geringes Hyphenwachstum. Erst bei Anwesenheit von bestimmten Wurzelexsudaten werden das Wachstum und die Verzweigung der Hyphen angeregt. Die entstehende Hyphe sucht den Kontakt zu einer Wurzel und dringt über ein Appressorium in die Wurzel ein. Man spricht von einer Endomykorrhiza. Ausgehend vom Appressorium dringt dabei der Pilz zwischen zwei epidermale Zellen bzw. in eine epidermale oder Haarzelle der Wurzel ein [16]. Die weitere Entwicklung des Pilzes in der Wurzel wird durch den Wirt beeinflusst. So ist es möglich, dass ein und dieselbe Pilzart verschiedene Morphologien in Abhängigkeit von ihrer jeweiligen Wirtspflanze aufweisen kann [17, 18]. Die beiden Hauptformen werden als Paris- und als Arum-Typ bezeichnet [19]. Aufgrund der größeren Bedeutung des Arum-Types für die Landwirtschaft konzentriert sich die bisherige Forschung auf diesen Typ. Im Lebenszyklus des Arum-Typs wächst die Pilzhyphe nach dem Eindringen in die Wurzel zunächst interzellulär. Beim Erreichen des inneren Kortex durchdringen Verzweigungen, die den interzellulären Hyphen entspringen, die kortikalen Zellwände. In den kortikalen Zellen kommt es zu einer Ausdifferenzierung der Hyphen zu stark verzweigten, terminalen Strukturen, die als Arbuskeln bezeichnet werden. Diese bäumchenartigen Strukturen gewährleisten den Austausch von Nährstoffen. Die Arbuskeln altern und sterben nach 4-10 Tagen ab. Die Pilzstrukturen werden von der Pflanze vollkommen abgebaut und die Pflanzenzelle erhält ihre ursprüngliche Morphologie zurück. Auf diese Weise ist es dem Pilz möglich, eine Rindenzelle ein zweites Mal zu penetrieren. Die Pflanze versorgt den Pilz mit Kohlenhydraten. Diese werden umgebaut und in Form von 8

11 1. Einleitung Lipiden in Vesikeln gespeichert. Anschließend werden extra- oder intraradikal neue Sporen gebildet. Außerhalb der Wurzel bildet der Pilz nur ein loses Hyphengeflecht. Die Dauersporen können sehr lange im Boden verbleiben; erst bei geeigneten Umweltbedingungen (Feuchtigkeit, ph-wert, Temperatur) bildet sich wieder ein Keimschlauch. Dieser kann sich bis zu zwei Wochen von den in der Spore befindlichen Lipiden, Proteinen und Glykogen ernähren. Diese Zeit kann er somit auch ohne pflanzlichen Symbiosepartner überdauern [20]. Abb. 1.2: Lebenszyklus der AM-Pilze [2]. Die arbuskuläre Mykorrhiza ist die verbreitetste Form dieser Symbiose zwischen Pilz und Pflanze. Daneben gibt es noch weitere Formen der Mykorrhiza. Die Ektomykorrhiza bildet ein Hartig sches Netz, ein interzelluläres dichtes Netzwerk aus Hyphen, die mit Gehölzpflanzen zusammenleben. Die Pilzhyphen wachsen dabei zwischen der Rhizodermis und den äußeren Rindenschichten des Wirtes. Bei dieser Form bilden Basidiomyceten, Ascomyceten oder Zygomyceten als Pilzpartner eine Symbiose mit Gymnospermen und holzigen Angiospermen. Weitere Mykorrhizaformen, welche der Anpassung an extreme Lebensräume dienen, sind: ericoide Mykorrhiza (vorwiegend bei Ericaceae, Empetraceae und Epacridaceae), Ectendo- Mykorrhiza, Orchideenmykorrhiza, monotropoide Mykorrhiza (vorwiegend bei Monotropoideae) und arbutoide Mykorrhiza [2]. 9

12 1. Einleitung Phylogenie der Glomeromycota speziell von G. intraradices Traditionell wurden die AM-Pilze zu den Zygomycota gestellt. In den letzten Jahren konnte aufgrund von molekularbiologischen Methoden geklärt werden, dass sie mit diesen nicht nahe verwandt sind und eine eigene natürliche Gruppe darstellen. Daraufhin wurden die AM-Pilze in ein fünftes Pilz-Phylum, die Glomeromycota, gestellt. Wie in Abb. 1.3 zu sehen ist, haben sie einen gemeinsamen Ursprung mit den Basidiomycota und den Ascomycota. Der hier dargestellte phylogenetische Stammbaum beruht auf SSU rrna Sequenzen [14]. Die rrna ist die ribosomale Ribonukleinsäure, die in Ribosomen vorkommt. Es handelt sich hierbei um non-coding RNA. Sie trägt somit keine genetischen Informationen, die in Proteine translatiert wird, sondern ist zusammen mit den ribosomalen Proteinen am Aufbau und der enzymatischen Aktivität des Ribosoms beteiligt. Da die Ribosomen in allen Organismen vorkommen, werden diese Sequenzen bevorzugt für phylogenetische Analysen genutzt. Abb. 1.3: Phylogenie der Pilze basierend auf SSU rrna Sequenzen [21]. Die Glomeromycota lassen sich Aufgrund von SSU rrna Sequenzen in vier Ordnungen einteilen, die Paraglomerales, die Archaeosporales, die Diversisporales und die Glomerales. G. intraradices findet sich in der Ordnung Glomerales, Familie Glomeraceae in Glomusgroup A (Abb. 1.4). 10

13 1. Einleitung Abb. 1.4: Phylogenie der Glomeromycota basierend auf SSU rrna Sequenzen [21]. 1.2 Morphologie von G. intraradices Sporen-Morphologie Die Farbe der G. intraradices-sporen variiert sehr stark. Die Farbpalette reicht von weiß über creme, gelb bis hin zu braun. Auch bei Form (kugelig bis elliptisch) und Größe ( µm) kann es zu großen Unterschieden kommen (Abb. 1.5 und 1.6). Die Sporenwand besteht aus drei Schichten L1, L2 und L3. In der Zellwand der heranreifenden Sporen und dem Hyphenansatz findet sich nur die farblose L1-Schicht, L2 und L3 werden dann während der weiteren Entwicklung der Sporen und des Hyphenansatzes gebildet [22]. 11

14 1. Einleitung Abb. 1.5: G. intraradices Spore in PVLG und Melzer s Reagenz (Foto: The Internal Bank for the Glomeromycota). Abb. 1.6: G. intraradices Spore in PVLG (Foto: AMykor GmbH) Extra- und intrazelluläre Strukturen Hyphen Diese Strukturen vermitteln den ersten Kontakt zwischen Pilz und Pflanze. Außerhalb der Wurzeln spricht man von extrazellulären Hyphen und innerhalb der Wurzel von intrazellulären Hyphen [22]. Arbuskel Da in den Arbuskeln der Stoffaustausch zwischen Pflanze und Pilz stattfindet, sind diese Strukturen mit feinen Kanälen durchzogen, um diesen Austausch mit einer hohen Produktivität zu gewährleisten. Arbuskel sind dünnwandige Strukturen innerhalb der Wirtszelle (intrazellulär), welche nur eine kurze Lebensdauer haben und von der Pflanze abgebaut werden [22]. Vesikel Vesikel sind ovale, dünnwandige Strukturen im Wurzelcortex, die aus Hyphen gebildet wurden. Sie dienen als Speichervesikel. Diese Strukturen sind typisch für die Ordnung Glomerales [22]. In Abb. 1.7 sind die beschriebenen Strukturen schematisch dargestellt. 12

15 1. Einleitung Appressorium Intrazelluläre Hyphen Interzelluläre Hyphen Vesikel Arbuskeln Abb. 1.7: Extra- und intrazelluläre Strukturen von G. intraradices [22]. 1.3 Taxonomische Bestimmung von AM-Pilzen Morphologische Untersuchungen von AM-Pilzen Die Taxonomie von AM-Pilzen basiert auf morphologischen Untersuchungen von Sporen aus Topf- und Gewächshauskulturen. Auf diese Weise konnten ca. 160 AM-Pilz-Arten anhand der Sporenmorphologie beschrieben werden. Allerdings ist diese Identifizierungsmethode nur begrenzt anwendbar, da die Produktion der Sporen bei Feldproben stark von physiologischen Parametern abhängt. Es können wichtige Merkmale verändert sein oder sogar fehlen. Somit ist nur eine Identifizierung auf Gattungsebene möglich. Morphologische Untersuchungen von gefärbten Wurzeln werden genutzt, um den Grad der Mykorrhizierung festzustellen. Unter bestimmten Umständen ist es auch möglich, Rückschlüsse auf die Familie zu ziehen, der der Pilz angehört. Mit Einführung der PCR konnte die Phylogenie der AM-Pilze erheblich gesicherter untersucht werden Molekularbiologische Untersuchungen von AM-Pilzen Um die zuvor erwähnten Probleme zu überwinden, wurden verschiedenste Methoden zur Identifizierung von AM-Pilzen erarbeitet. Hahn fand 1993 einen Ansatz über serologische Verfahren [23]. Rosendahl und Sen beschrieben 1992 eine Isozym-Analyse [24]. Bentivenga und Morten (1994) beschäftigten sich mit der Fettsäure-Variation bei AM-Pilzen [25] und 1993 beschrieb Simon [26] [13] und 2000 auch Redecker [27] Methoden zur Identifizierung von AM-Pilzen mittels DNA-Analyse. Um diese Methoden zu etablieren wurde mit in vitro kultivierten AM-Pilzen gearbeitet. 13

16 1. Einleitung 1.4 In vitro Kultur von AM-Pilzen und bisher verwendete Wirtspflanzen Im Jahr 1962 publizierte Mosse [28] die erste wissenschaftliche Abhandlung über die Etablierung von sterilen AM-Pilzen. Mit folgendem initialem Satz begann sie ihre Ausführungen: For a critical study of the effects of vesicular-arbuscular mycorrhiza on plant growth, typical infections must be produced under controlled microbiological conditions. (Um die Effekte der vesikular-arbuskulären Mykorrhiza auf das Pflanzenwachstum zu untersuchen, muss die Infektion unter kontollierten, mikrobiologischen Bedingungen erfolgen.) Die von Mosse beschriebene Kulturfürung war dixenisch (AM-Pilz und zwei anderen Organismen) und bestand aus einem AM-Pilz (zu dieser Zeit als Endogone sp. bekannt), sterilen Sämlingen verschiedener Pflanzenarten und Pseudomonas sp. [28] Erst 1975 beschrieben Mosse und Hepper [29] die erste in vitro Kokultur zwischen einer Wurzelkultur und einer kontaminationsfreien Glomus Spezies (Endogone mosseae). Aufgrund der Schwierigkeiten, welche diese Methode mit sich brachte, geriet diese für mehr als ein Jahrzehnt in Vergessenheit. Hepper versuchte in den Jahren 1976 bis 1987 [30-36] axenische AM-Pilz-Kulturen ausgehend von Sporen zu produzieren; allerdings ohne Erfolg. Auch unter Einsatz verschiedener chemischer Komponenten, wie organische Säuren, Aminosäuren, Vitamine oder aber Wurzelexudaten [33] [37] und pflanzlichen Zellkulturen [38] konnte die Keimung zwar gesteigert werden; allerdings nur bis zu einem bestimmten Punkt. Heute wissen wir, dass es sich bei den Glomerales um obligat biotrophe Organismen handelt und 1987 publizierten Strullu und Romand [39] [40] ihre Forschungsergebnisse über die Nutzung von intraradikalem Pilzmaterial für die Etablierung einer monoxenischen Kultur (In Vitro Kultur) von verschiedenen Glomus Spezies formulierten Becard und Fortin [41], unter Berücksichtigung der Ideen von Mugnier und Mosse [42] die Bedingungen für eine monoxenische AM-Kultur neu. Ein wichtiger Meilenstein in der Entwicklung der monoxenischen AM-Kultur wurde 1996 mit der erfolgreichen Nutzung von Bi-Kompartment-Petrischalen erreicht [43]. Nun war die physikalische Trennung zwischen extraradikalem AM-Pilzmyzel und Wirtswurzel möglich und damit konnten große Mengen von AM-Pilzmateriel, speziell Sporen und Hyphen, getrennt vom Wirt aber immer noch im symbiotischen Stadium, hergestellt werden (der Pilz ist immer noch mit dem Wirt verbunden aber räumlich getrennt). So produziertes Pilzmaterial bildet heute die Grundlage für viele molekularbiologische Studien über AM-Pilze. 14

17 1. Einleitung Viele der bis heute beschriebenen monoxenischen AM-Kulturen nutzen Ri T-DNA transfizierte Wurzelkulturen als Wirt (siehe Tab. 1.1). Diese natürliche Transfektion von Pflanzenwurzeln wird mit Hilfe des ubiquitär vorkommenden Bodenbakteriums Agrobacterium rhizogenes erreicht, welches das Ri T-DNA Plasmid integriert. Die so behandelte Pflanze bildet dann nur noch Wurzeln, die sogenannten hairy roots [44]. Transfizierte Wurzelsysteme zeigen ein höheres Wachstumspotential und mehr extraradikales Hyphenwachstum als nicht-transfizierte Wurzeln. Tab. 1.1: Wurzelkulturen welche zurzeit als Wirt für die monoxenische AM-Kultur genutzt werden. Pflanze Deutsche Ri T-DNA Referenz Bezeichnung transfiziert Daucus carota L. Wilde Möhre ja [41] Medicago truncatula L. - ja [45] Lycopersicon esculentum Tomate ja [46] Mill. Pisum sativum L. Erbse ja [47] Fragaria x Ananassa Duch. Erdbeere ja [48] Trifolium repens L. Weißklee ja [49] Linum usitatissimum L. Flachs ja [50] Tagetes patula L. Studentenblume ja [50] Althaea officinalis L. Echter Eibisch ja [50] Trifolium pratense L. Rot-Klee nein [29] Fragaria x Annanssa Duch. Erdbeere nein [39] Solanum lycopersicon Mill. Tomate nein [40] Medicago sativa L. Luzerne nein [51] Lycopersicon esculentum Tomate nein [51] Mill. Helianthus annuus L. Sonnenblume nein Bago et al. (nicht publiziert) 1.5 Bisher identifizierte und charakterisierte AM-Pilz-Gene In den letzten Jahren wurde viel Kraft in die Erforschung der Mykorrhiza-Entwicklung investiert. Es wurden diverse symbioserelevante Gene isoliert und charakterisiert. Dies und die Charakterisierung von pflanzlichen Mutanten mit abnormen AM Phänotypen [52] bilden zusammen mit neuen molekularbiologischen Techniken, wie subtraktive und differentielle Hybridisierung von cdna Banken, eine gute Grundlage für das bessere Verständnis von Entstehung und Physiologie der Mykorrhiza [53]. Es wurden viele Pflanzengene, welche während der Mykorrhiza-Entwicklung differenziell exprimiert werden, in den letzten Jahren identifiziert und beschrieben [54-60]. Auch AM- 15

18 1. Einleitung Pilz-Gene wurden identifiziert [61-67]; allerdings konnte nur für eine kleine Anzahl gezeigt werden, dass sie eine wichtige funktionale Rolle in der Entwicklung der Symbiose spielen. Eines der wichtigsten bisher beschriebenen Pilz-Gene ist der pilzliche (Glomus versiforme) Phosphattransporter, welcher vermutlich für die initiale Phosphat-Aufnahme durch den Pilz aus dem Boden verantwortlich ist [68]. Neben diesen universellen Pilz-Genen konnten noch weitere Gene, welche während der symbiotischen Phase exprimiert werden, identifiziert werden [69-73]. Die Identifikation von AM-Genen ist besonders schwierig, da es sich bei AM-Pilzen, wie bereits beschrieben, um obligat biotrophe Organismen handelt. Dies und die Tatsache, dass nur Sporen und Hyphen als Ausgangsmaterial für molekularbiologische Untersuchungen genutzt werden können, limitiert die Menge an verwendbarem pilzlichen Materials. Zudem ist die Menge an lebendem AM-Pilzmaterial in der Pflanzenzelle relativ gering, verglichen mit anderen Interaktionen zwischen Pflanzen und Mikroorganismen. Nur ungefähr ein Prozent der aus hoch mykorrhizierten Wurzeln isolierten mrna ist pilzlichen Ursprungs, was die Identifikation von gering exprimierten Pilzgenen behindert [74]. 1.6 Zielsetzung Mykorrhizierte Pflanzen besitzen gegenüber nicht-mykorrhizierten Pflanzen einen entscheidenden Wachstumsvorteil. Zudem sind mykorrhizierte Pflanzen gegenüber abiotischen und biotischen Stressbedingungen resistenter und haben zum Beispiel eine höhere Überlebensrate nach dem Aus- bzw. Umpflanzen. Dies führt zur praktischen Nutzung von Mykorrhiza-Inokulaten bei der Rekultivierung, in der Forstwirtschaft, im Gartenbau und der Intensivlandwirtschaft. In allen Böden ist eine autochthone arbuskuläre Mykorrhiza vorhanden, deren Anzahl (Diversität an Pilzspezies), Konzentration (infektive Einheiten pro g Boden) und Effektivität (Nutzen für die Pflanze) unter natürlichen Bedingungen völlig unbekannt ist. Diese autochthone Mykorrhiza-Pilz-Population ist oft defizitär [75], das heißt, sie kann eine vollständige und optimale Mykorrhizierung der angebauten Pflanzen nicht gewährleisten. Deshalb werden aus der Umwelt selektierte und unter kontrollierten Bedingungen vermehrte AM-Pilze als Inokulate bei der Aussaat oder Pflanzung dem Boden zugegeben. Auf diese Weise lässt sich sicherstellen, dass Kulturpflanzen mit wirksamen Pilzen assoziieren. Dies kann z.b. in einer Ertragsteigerung ohne zusätzliche Düngergaben resultieren oder zu einer effizienteren Nutzung der Düngezugaben führt, da die selektierten Pilze (im Mykorrhiza- Inokulum) eine höhere Effizienz haben, als die autochthone Mykorrhiza. Andere nützliche 16

19 1. Einleitung Eigenschaften der inokulierten Mykorrhiza-Pilze können eine verbesserte Trockenresistenz, Schwermetallresistenz und geringere Anfälligkeit gegen Wurzelkrankheiten sein. Intensives Durchdringen des Bodens mit Mykorrhiza-Pilz-Hyphen fördert auch langfristig und nachhaltig die Bodenstruktur. So werden Mykorrhiza-Inokula zur Stabilisierung von z.b. Sanddünen weltweit eingesetzt. Mykorrhiza-Pilzarten unterscheiden sich in ihrer Effektivität, d.h. verschiedene Arten und möglicherweise selbst Herkünfte (Isolate aus bestimmten Ökosystemen) von bestimmten Arten können das Pflanzenwachstum unterschiedlich stark fördern [75, 76]. Feldmann und Grotkass [76] weisen darauf hin, dass für Wirkungsunterschiede zwischen Herkünften derselben AM-Pilzart genetische Faktoren der Herkünfte verantwortlich sind. Solche Wirkungsunterschiede zwischen verschiedenen AM-Pilzarten oder deren Herkünften wurden bisher in aufwendigen biologischen Versuchen bestimmt, welche oft mehrere Jahre in Anspruch nahmen. Für Firmen, wie die AMykor GmbH Wolfen, die ein AM-Inokulum herstellt und vertreibt, ist es von entscheidender Wichtigkeit, dass die im Inokulum verwendeten Pilzarten und Herkünfte unter den verschiedenen Bedingungen der Inokulation jeweils die besten und optimalen Wirksamkeiten für die Pflanzenproduktion zeigen. Es ist daher verständlich, dass ein erhöhtes Interesse an Methoden besteht, die es erlauben, relativ einfach und schnell solche AM-Pilzarten bzw. Isolate zu identifizieren, die unter definierten suboptimalen Umweltbedingungen (z.b. Salzstress, Schwermetallstress, Trockenheit, niedrige ph-werte etc.) wachsen und Pflanzen infizieren können. Nur die Pilzarten, die solchen Charakteristiken entsprechen, können dann dem aufwendigen Prozess der Massenvermehrung unterworfen werden. Ein Lösungsansatz für eine relativ schnelle Identifizierung von AM-Pilzisolaten kann gegebenenfalls mit molekularbiologischen Methoden gefunden werden. So könnten Gene und Genprodukte, die bei der Keimung der AM-Pilze und bei der Etablierung der Symbiose zwischen AM-Pilz und Pflanze exprimiert werden, Aufschluss über die Wirksamkeit bzw. Anpassung der Symbiose an bestimmte Umweltbedingungen geben, wenn die metabolische Funktion dieser Genprodukte bekannt ist. Dazu sind molekularbiologische Untersuchungen zunächst als Grundlage in einem extrem stark kontrollierten System (in vitro Symbiose unter kontrollierten Bedingungen im Labor) nötig. Die vorgesehenen Untersuchungen besitzen eine hohe Praxisrelevanz, weil die Erhöhung der Pflanzenqualität allein durch Aktivierung eines natürlichen Prozesses, der Symbiose, erreicht 17

20 1. Einleitung wird. Die z.b. von der Firma AMykor, Wolfen, entwickelten Plant Vitalising Systems (endotrophe Mykorrhiza-Pilz-Inokula) stellen eine neue Produktgruppe dar, die zur Zeit in vielen Ländern etabliert wird. Anwendung finden diese Präparate bei der Rekultivierung, beim Anbau auf Problemstandorten aber auch in der Intensivlandwirtschaft und im Forst. Besonders im ökologischen Landbau besteht ein beträchtlicher Wachstumsmarkt. Das anwendungsorientierte Ziel des Vorhabens ist es, die Grundlagen für weiterführende Untersuchungen zu schaffen, welche ausgerichtet sein können auf: Selektionen von Pilzarten und Isolaten mit optimalen Wirksamkeitsgraden, Kontrolle und Überprüfung der einzelnen Pilzentwicklungsstadien in der Produktion von Inokula, Gezielte Beeinflussung (z.b. Verstärkung) einzelner Entwicklungsstadien des Pilzes in der Symbiose, Verbesserung der Charakterisierung von kommerziellen Inokula, da diese aus Hyphen, Sporen und Wurzelresten der Wirtspflanze bestehen, Verbesserung der Qualität von kommerziellen Produkten, Schaffung von neuen, unter sterilen Bedingungen produzierten Produkten (Inokulaten) auf Hyphen- und Sporenbasis. Um diese Grundlagen zu schaffen, muss zunächst der von der AMykor GmbH genutzte und für diese Arbeit zur Verfügung gestellte in vivo vermehrte Produktionsstamm in eine in vitro Kultur überführt werden. Es sollen verschiedene transfizierte Wurzelsysteme hergestellt, getestet und genutzt werden. Die zuvor mit Hilfe von subtraktiver Hybridisierung identifizierten putativen Gene sollen als Markergene genutzt werden. Die so etablierte in vitro Kultur soll dann von der Firma AMykor GmbH in Massenproduktion hergestellt und vertrieben werden. 18

21 2. Materialien und Methoden 2. Materialien und Methoden 2.1 Materialien Geräte Tischzentrifuge Biofuge pico, Heraeus Instruments Thermomixer 5436, Eppendorf Vortexer Vortex Genie2, Scientific Industries INC. Wasserbad GFL, Gesellschaft für Labortechnik mbh Celloshaker Variospeed, Chemetron Products Inkubationsschrank Heraeus Instruments Schüttler Infors Multitron, HAT Gel-Dokumentationssystem Gene Genius Bio Imaging Systeme, Syngene Thermocycler Mastercycler ep gradient S, Eppendorf Mikroskop Stemi SV6, Zeiss Kamera AxioCam MRc, Zeiss DNA Speed Vac DNA 100, Savanta Chemikalien Soweit nicht anders vermerkt wurden Chemikalien der Firmen Sigma-Adrich, Roth und Merck verwendet Oligonukleotidprimer In Tab. 2.1 sind die in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotidprimer aufgeführt. Tab. 2.1: Oligonukleotidprimer Bezeichnung NS5 ITS4i Glom1310i Sequenz 5 -AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA-3 5 -TTG ATA TGC TTA AGT TCA GCG-3` 5 -AGC TAG GCC TAA CAT TGT TA-3 Tm in C Beschreibung/Referenz 52,0 rdna spezifisch [26, 29-33] 54,0 rdna spezifisch [26, 29-33] 53,2 rdna spezifisch 19

22 2. Materialien und Methoden KW1 KW2 KW3 AP1 AP2 PT1 PT2 Tef1 Tef2 Tub1 Tub2 ubifor ubirev Dauc1/1a Dauc1/1b ASYM1 ASYM2 cdnabin1 cdnabin2 Zfin1 Zfin2 APSC-CP1 APSC-CP2 walksy2r1 walksy2r2 walksy2r3 walksy2r4 DIG APSC-CP 5 -AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTA CGC GGG-3 5 -AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTA CT (30) VN-3 5 -AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GT-3 5 -AAG TTC CAA CTT TTA TTA CAG-3 5 -ATC GCT CTA CTA TGT ATA AAT-3 5 -ATG TCT ACA TCC GAT AGA GTA-3 5 -GTG TTT ATA TTA GAT ATA TTA TGT-3 5 -GCC CTT ACT TGA TTT ACA AGT-3 5 -TTG ACC GTC CTT GGA GAT A-3 5 -TAC CAT GGA CTC CGT TCG T-3 5 -GAC GTG GAA AAG GCA CCA TA-3 5 -ATG CAG ATY TTT GTG AAG AC-3 5 -ACC ACC ACG RAG ACG GAG-3 5 -ATG GGT GCC CAG AGC CAT-3 5 -GTT AGC AAT GAG GTA GGC C-3 5 -ATG AGC GAC ACA AAC CAG-3 5 -CGA ATA CGA TTC ATC AGA TTT-3 5 -ATG TTT GTG AGC TTC TTT CT-3 5 -ATG TCT GAA CCA TCC AGA G-3 5 -ATG TGC AAA CAT ATA CTT AAC G-3 5 -AAG TCT TGA TTG AGA ATA CTC T-3 5 -ATG GGA GAT TCT ATA GAA AG-3 5 -CCT TTA GTA CCA AGG AAG A-3 5 -AAG TTC TTG AGG AAC TTC AT-3 5 -GCT AAT GCT CTT GAA GCA A-3 5 -CGC CTT GAG TTT GAT CAA GT-3 5 -TAC AGC CAA AGT CTT CCT TG-3 5 -ATG GGA GAT TCT ATA GAA AG_DIG ,9 cdna Synthese 67,4 cdna Synthese 60,6 cdna Synthese 50,1 Alkalische Phosphatase 50,1 Alkalische Phosphatase 54,0 Phosphattransporter 49,1 Phosphattransporter 54,0 Transkriptions-Elongationsfaktor 54,5 Transkriptions-Elongationsfaktor 56,7 β Tubulin 57,3 β Tubulin 53,0 Ubiquitin zur cdna-kontrolle 60,0 Ubiquitin zur cdna-kontrolle 58,0 Daucus carota major allergene 57,0 Daucus carota major allergene 55,0 54,0 Transkriptions-Initiationsfaktor (putativ) Transkriptions-Initiationsfaktor (putativ) 52,0 cdna-binde-protein (putativ) 55,0 cdna-binde-protein (putativ) 55,0 Zink-finger Protein (putativ) 55,0 Zink-finger Protein (putativ) 52,0 53,0 52,0 53,0 56,0 56,0 52,0 Anucleate-Primary-Sterigmatacoiled-coil-Protein (putativ) Anucleate-Primary-Sterigmatacoiled-coil-Protein (putativ) Anucleate-Primary-Sterigmatacoiled-coil-Protein (putativ) Anucleate-Primary-Sterigmatacoiled-coil-Protein (putativ) Anucleate-Primary-Sterigmatacoiled-coil-Protein (putativ) Anucleate-Primary-Sterigmatacoiled-coil-Protein (putativ) Anucleate-Primary-Sterigmatacoiled-coil-Protein (putativ)

23 2. Materialien und Methoden Ubifus1 Ubifus2 SY35-1 SY35-2 SY41-1 SY41-2 Sy52-1 Sy52-2 walksy52r1 walksy52r2 SY1-6u1 SY1-6u2 SY1-8u1 SY1-8u2 DIG FAO Sy1-17r1 Sy1-17r2 Sy1-18u1 Sy1-18u2 Sy1-24u1 Sy1-24u2 Sy1-31r1 Sy1-31r2 AS2-19u1 AS2-19u2 AS2-24u1 AS2-24u1 SSHW1_1_ GTG TTT ACA CCC CTT GAA A-3 5 -AAG TTG ATC AGG TTG AAT ATA-3 5 -ATG AAT GGG ATA ATA ATT TTA T-3 5 -GGG TTG AAA GTG GTG CC-3 5 -ATG GGA GAT TCT ATA GAA AG AAT TTG GTC CAC CCG AAG-3 5 -ATG TGG AAA ATG AAG ATC ATT-3 5 -AAT AAC TGG TCC ACC AGG-3 5 -CAG TAG TTT CAA TAA GAT CC-3 5 -CTC AAA TTC ATT ATG AGG CA-3 5 -GTG GTA TCA ACG CAG AGC A-3 5 -GCG TGG TCG CGG CCG A-3 5 -GTG CCA TTT AGT AAA ACA GGA-3 5 -CCA GCA GCA CCA ATG ATA A-3 5 -GTG CCA TTT AGT AAA ACA GGA_DIG-3 5 -ATG TTG CTC AGA CTG TTA GC-3 5 -GCG TGG TCG CGG CCG A-3 5 -GTG GAG TTA AAC TTA CAC GTT-3 5 -AAA AAC ATC TCT AGT TGG TTC T-3 5 -ATG GCA TTA TTA AAT TTG ACG AA-3 5 -CAG GTT TAA ACG AAT TCG CC-3 5 -ATG GAC GTG GAA GCG AGA-3 5 -GCG TGG TCG CGG CGG CCG A-3 5 -ATG GTA CGC GGG GGA CAA-3 5 -TTA TTA CAT ATT GAC TGT CGG-3 5 -ATG TAC CAT TGC TTA AGC AGT-3 5 -TAC TCT GCG TTG ATA CCA CT-3 5`-ACA TCT ACT TCC CTA TCA GT ,0 Ubiquitin-fusions-Protein (putativ) 52,0 Ubiquitin-fusions-Protein (putativ) 49,0 55,0 Nascent Polipeptide-associated complex (putativ) Nascent Polipeptide-associated complex (putativ) 52,0 Tubulin-binde Protein (putativ) 54,0 Tubulin-binde Protein (putativ) 52,0 Septin-Ring Protein (putativ) 54,0 Septin-Ring Protein (putativ) 52,0 Septin-Ring Protein (putativ) 52,0 Septin-Ring Protein (putativ) 57,0 Transaldolase (putativ) 61,0 Transaldolase (putativ) 55,0 Fettsäuredioxygenase (putativ) 55,0 Fettsäuredioxygenase (putativ) 55,0 Fettsäuredioxygenase (putativ), DIG-modifiziert 56,0 Ornithindekarboxylase (putativ) 61,0 Ornithindekarboxylase (putativ) 55,0 RNA-Polymerase II (putativ) 55,0 RNA-Polymerase II (putativ) 54,0 ABC-Transporter (putativ) 56,0 ABC-Transporter (putativ) 57,0 Mat-2-Protein (putativ) 61,0 Mat-2-Protein (putativ) 58,0 Ribonuclease H (putativ) 55,0 Ribonuclease H (putativ) 55,0 56,0 Cellolusomal anchoring Protein (putativ) Cellolusomal anchoring Protein (putativ) 54,0 CP2 Transkriptionsfaktor (putativ) SSHW1_1_1-2 5`-TGG AAC CAC TGG ATT 55,0 CP2 Transkriptionsfaktor (putativ)

24 2. Materialien und Methoden SSHW1_1_4-1 SSHW1_1_4-2 SSHW1_1_13-1 SSHW1_1_13-2 SSHW1_1_14-1 SSHW1_1_14-2 SSHW1_1_14-3 SSHW1_1_15-1 SSHW1_1_15-2 SSHW1_2_23-1 SSHW1_2_23-2 SSHW3_1_56-1 SSHW3_1_56-2 SSHW3_1_65-1 SSHW3_1_65-2 SSHW3_1_66-1 SSHW3_1_66-2 SSHW3_1_84-1 SSHW3_1_84-2 DGAT1 DGAT2 DIG GAT AD1 AD2 AD3 AD4 GTG A-3 5`-AGT TTG CGT AGA TAT TGA AG-3 5`-TAA CAA AAC TCG ACC TGT CC-3 5`-TTC ATC AGT TAG ATT ATT ACC A-3 5`-CTT TCC ATC TCA TAA GGA TG-3 5`-ATG TAT AAC ACT AAT AAG TCA AA-3 5`-GCG CAT GAA TGA CGA TGA T-3 5`-AAC AAT AAT TTG AGT GAC ACG-3 5`-ATA TAA GGA GGT TTG AAA ATT T-3 5`-ATG TTA CCT TTA TTC TCA AGT A-3 5`-AAG TAT TTA CAG TTT CAG TAG-3 5`-ATT CTA AGC CCT CGG CGT-3 5`-ACT CCA ATG ACT TAC CTT AAT-3 5`-CTT AGC GTG GTC GCG GC-3 5`-TAT TCA TTA ATA ATG AAT TCG TTG-3 5`-TAT GAG CCC ATT TAA CTG CT-3 5`-GCA GGT ACT TCG CGA AGT-3 5`-CCT GGA TTA TGC TTT ATC TAT-3 5`-ATC CTG GTC ATG GAA TGA G-3 5`-TAC ATG TCC ATC AAG TTC TTT-3 5`-ATG GAR CAR GTN CAR GTN-Wobbles-3 5`-CGN TAD TAC TGN TAC CTR-Wobbles-3 5`-GCA GGT ACT TCG CGA AGT TGT-DIG-3 5`-ATG VSN RRN YWN WNN VMN-Wobbles-3 5`-NCG RAA NRD NVM NYG NGG-3 5`-ATG WSN GAY YTN TTY CAN-Wobbles-3 5`-CGN AAR RAN CGN CTR CCN-Wobbles ,0 56,0 53,0 54,0 Leucine rich repeat containing protein (putativ) Leucine rich repeat containing protein (putativ) Vesiclemediated transport protein Vid24 (putativ) Vesiclemediated transport protein Vid24 (putativ) 52,0 Glutaminsynthetase (putativ) 55,0 Glutaminsynthetase (putativ) 54,0 Glutaminsynthetase (putativ) 51,0 Kupferradikaloxidase (putativ) 53,0 Kupferradikaloxidase (putativ) 52,0 56,0 Lipiddroplet-associated perlipin protein (putativ) Lipiddroplet-associated perlipin protein (putativ) 54,0 CP2 Transkriptionsfaktor (putativ) 60,0 CP2 Transkriptionsfaktor (putativ) 53,0 Aldehyddehydrogenase (putativ) 54,0 Aldehyddehydrogenase (putativ) 56,0 54,0 55,0 54,0 53,0 51,0 61,0 Diacylglycerol o-acyltransferase (putativ) Diacylglycerol o-acyltransferase (putativ) mrna binde Protein Pumilio 2 (putativ) mrna binde Protein Pumilio 2 (putative) Diacylglycerol o-acetyltransferase (putativ) Diacylglycerol o-acetyltransferase (putative) Diacylglycerol o-acetyltransferase (putativ), DIG-modifiziert 52,0 Aldehyddehydrogenase (putativ) 57,0 Aldehyddehydrogenase (putativ) 49,0 Aldehyddehydrogenase (putativ) 57,0 Aldehyddehydrogenase (putativ) DIG AD 5`-TAT TCA TTA ATA ATG 53,0 Aldehyddehydrogenase (putativ),

25 2. Materialien und Methoden FR1 FR2 SyW135_1 SyW135_2 SyW142_1 SyW142_2 SyW201_2 SyW201_3 FR3 NT1 NT2 FR4 FR5 FR6 SyW201_4 FR7 FR8 FR9 DIG FR FRINV FRQIA AAT TCG TTG_DIG-3 5`-ATG GCT AGT CAA ATT ATT GTC G-3 5`-YAN CTY RAN WSN SRN YKN SWN-Wobbles-3 5`-GAT TTC TCA AGA CTT ATG AGA T-3 5`-ATT AAA GGT GTC ATC CAA ATT AT-3 5`-ATA ATA TCT TTA AGT TGC CTG CTC-3 5`-CCA ATT CAA GGT GAA GCT GG-3 5`-CCC AGT CGG ATG TAC TTC AA-3 5`-TTC AAG TAC ATC CGA CTG GG-3 5`-HSN TTY YAN TKN CCN TAD CAN-Wobbles-3 5`-GGC AAC TGA CAT TAA TCT CAT-3 5`-ATG CTC TTG AAG CAA AGA ACA-3 5`-GTY TTY CAN TGN RAN CTY CAN-Wobbles-3 5`-CAN CTY GGN TGN RAN CTY TAD-Wobbles-3 5`-GTY TGN GGN WSN RAN CTY-Wobbles-3 5`-GAC CAG ATA TTT ATG ATT TAC C-3 5`-ATC GTC TTG GTG GAT CAT CT-3 5`-GGT GGT ATT TCT GTC ACA AAA-3 5`-CAT AAT ACT GAA CAA GAT TGT T-3 5`-ATG GCT AGT CAA ATT ATT GTC GG_DIG-3 5`- TTT TGT GAC AGA AAT ACC ACC C-3 5`- TTA TTT TGT GAC AGA AAT ACC AC-3 DIG-modifiziert 57,0 Fumaratreduktase (putativ) 59,0 Fumaratreduktase (putativ) 55,0 54,0 HD Phosphohydrolase-domaincontaining protein (putativ) HD Phosphohydrolase-domaincontaining protein (putativ) 58,0 Ornithinaminotransferase (putativ) 58,0 Ornithinaminotransferase (putativ) 58,0 Fumaratreduktase (putativ) 58,0 Fumaratreduktase (putativ) 57,0 Fumaratreduktase (putativ) 55,0 Nitrattransporter (putativ) 55,0 Nitrattransporter (putativ) 57,0 Fumaratreduktase (putativ) 59,0 Fumaratreduktase (putativ) 55,0 Fumaratreduktase (putativ) 55,0 Fumaratreduktase (putativ) 56,0 Fumaratreduktase (putativ) 55,0 Fumaratreduktase (putativ) 53,0 Fumaratreduktase (putativ) 57,0 Fumaratreduktase (putativ), DIGmodifiziert 58,0 Fumaratreduktase (putativ) 56,0 Fumaratreduktase (putativ) Enzyme Taq I Restriktionsendonuklease RNase A Ampli Taq DNA-Polymerase DNase Power Script Reverse Transkriptase Fermentas Qiagen Applied Biosystems Qiagen Applied Biosystems 23

26 2. Materialien und Methoden Super Script 2 Reverse Transkriptase RNaseOUT Ribonuclease Inhibitor T4 Ligase Invitrogene Invitrogene Fermentas Kit Systeme DNeasy Plant Mini Kit RNeasy Mini Kit Spectrum Plant Total RNA Kit AllPrep DNA/RNA Mini Kit BD SMART PCR cdna Synthesis Kit BD PCR-Select cdna Subtraction Kit TOPO Walker Kit Qiagen Qiagen Sigma Qiagen BD Biosciences BD Biosciences Invitrogene Medien, Puffer und Färbelösungen Chelex 100 Resin - 20 % w/v, Bio-Rad, Hercules, CA - in Aqua dest. gelöst Trypanblaufärbelösung für Wurzeln - 0,1 % Trypanblau - Glycerin, 5 %ige Milchsäure und Aqua dest. (1:1:1) Diese Lösung kann bei Aufbewahrung im Kühlschrank wieder verwendet werden. Entfärber für Wurzeln - Glycerin, 5 %ige Milchsäure und Aqua dest. (1:1:1) Diese Lösung kann bei Aufbewahrung im Kühlschrank wieder verwendet werden. dntp s - Standardlösungen Roche 100 mm - 10 mm datp - 10 mm dctp 24

27 2. Materialien und Methoden - 10 mm dgtp - 10 mm dttp TB-Puffer für DNA-Elektrophorese - 0,1 M Tris/HCl - 0,2 mm EDTA - 0,1 M Borsäure (H 3 BO 3 ) Der ph-wert sollte zwischen 8,1 8,5 liegen. DNA-Ladepuffer (Stopper) - 10 mm Tris, ph 8,0-50 % (v / v) Glycerin % (w / v) Bromphenolblau (auch ohne wenn sehr kleine Fragmente) % (w / v) SDS Nährmedien LB-Medium (Luria-Bertani Broth) - LB Vollmedium von Gibco (verwendet laut Hersteller-Beschreibung) B5-Medium (Gamborg s B5 Basal Medium mit Minimal Organics, SIGMA G-5893) - 3,19 g/l B5 Medium - 20 g/l Saccharose - 6 g/l Plant-Agar ph-wert 5,6 MW-Medium, MSR-Medium und Citrat-Puffer [77] - verwendet wie im Buch In Vitro Culture of Mycorrhiza beschrieben MYA-Medium [78] - 5,0 g/l Hefeextrakt - 0,5 g/l Casamino acids - 0,044 M Mannitol (C 6 H 8 (OH) 6 ) - 0,015 M (NH 4 ) 2 SO 4-0,09 M NaCl 25

28 2. Materialien und Methoden - 15,0 g/l Agar ph-wert 6,6 MS(T)-Medium - 4,4 g MS (incl. Vit.) (M 0222, Duchefa) - 20 g Saccharose - 2,5 mm MES - 7 g/l Agar ph-wert 5,8 CPY-Medium - 1 g/l Hefeextrakt - 5 g/l pankreatisches Pepton - 5 g/l Saccharose - 0,02 M MgSO 4 x 7 H 2 O ph-wert 7,2 MSR-Medium (modified Strullu-Romand Medium) [33, 34] Die Zusammensetzung des Mediums ist im Buch In Vitro Culture of Mycorriza von S. Declerck beschrieben [31]. Plasmidisolation Lysemedium - 25 mm Tris - 10 mm EDTA - 0,9 % Glukose ph-wert 8,0 alkalische SDS Lösung - 1 % SDS - 0,2 N NaOH 3 M Natriumacetat - ph-wert mit Essigsäure auf 4,9 einstellen 26

29 2. Materialien und Methoden TE-Elutionspuffer (1 x) - 10 mm Tris - 1 mm EDTA (ph 8,0) Aqua dest ml Filter-Hybridisierung 1x PBS - 1,7 mm KH 2 PO 4-5,2 mm NA 2 HPO mm NaCl 5x SSPE - 3 M NaCl mm NaH 2 PO mm EDTA ph-wert 7.4 mit NaOH Puffer I - 4 M NaCl - 1 M Tris/HCl, ph 7,5 Puffer II - 4 M NaCl - 0,05 M MgCL 2-1 M Tris/HCl, ph 8,0 Hybridisierungs-Puffer - 40,0 ml 5x SSPE - 0,1 % n-lauroyl. - 0,5 M NaCl Blockinglösung - 40 ml PBS 27

30 2. Materialien und Methoden - 0,1 % Tween20-0,2 % BSA Loading Puffer - 10 ml PBS - 0,05 % Tween20-2 % Polyvinylpyrrolidone (Sigma) - 0,2 % BSA Färbelösung - 10 ml Aqua dest. - 0,75 mg/ml p-nitrophenyl-phosphat - 9,5 % Diethanolamine Pilz-, Pflanzen-, Bakterienstämme/-arten und kommerzielle Mykorrhiza-Präparate In den Tab. 2.2, 2.3 und 2.4 sind die verwendeten Bakterienstämme, Pflanzen und Wurzelkulturen und kommerzielle Mykorrhiza-Präparate aufgeführt. Tab. 2.2: Verwendete Bakterienstämme. Stamm Genotyp Herkunft/Referenz E.coli Top 10 F- mcra (mrr-hsdrms-mcrbc) φ80lacz M15 lacx74 reca1 arad139 (araleu) 7697 galu galk rpsl (StrR) enda1 nupg Invitrogen One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli Agrobacterium rhizogenes A4 Agrobacterium rhizogenes WT WT Frankreich, INRA, Versailles Cedex, Prof. D. Tepfer Deutschland, Gatersleben, Dr. I. Saalbach Tab. 2.3: Verwendete Pflanzen und Wurzelkulturen. Pflanze Genotyp Herkunft/Referenz Fragaria x Ananassa Duch. Gartenerdbeere, oktoploid, Hybrid aus Chile- und Scharlach-Erdbeere Deutschland, Gatersleben, Gudrun Oswald (AMykor GmbH) Daucus carota Zuchtsorte (500) Deutschland, Gatersleben Genbank Akz.-Nr: DAU 160 = Daucus carota L. 28

31 2. Materialien und Methoden subsp. sativus (Hoffm.) Arcang. Ursprungsland Niederlande Helianthus annuus L. Zuchtsorte (500) Deutschland, Gatersleben Genbank Akz.-Nr: HEL 415 = Helianthus sp. Jaszberenyi Ursprungsland unbekannt (S1) Helianthus annuus L. Zuchtsorte (500) Deutschland, Gatersleben Genbank Akz.-Nr: HEL 428 = Helianthus sp. Arielle Ursprungsland unbekannt (S2) Daucus carota in DC1 Belgien, BCCM/MUCL, S. Declerck vitro Wurzelkultur Tagetes spez. patula WT Deutschland Vetiveria zizanioides Klon Australien Australien Vetiveria zizanioides Klon Texas Texas Tab. 2.4: Verwendete kommerzielle Mykorrhiza-Präparate. Isolat/kommerzielles Präparat Bezeichnung Taxonomisch bestimmt als Herkunft AMykor 04Z AZ G. intraradices Deutschland, Bitterfeld-Wolfen, AMykor GmbH AMykor 04-05S AS G. intraradices Deutschland, Bitterfeld-Wolfen, AMykor GmbH AMykor Tri-Ton TT G. intraradices Deutschland, Bitterfeld-Wolfen, AMykor GmbH MYCOSTAR Inokulum MS G. intraradices Thailand TERI-In vitro Inokulum TE G. intraradices Indien, New Delhi Bothe Inokulum 2003 AB G. intraradices Deutschland, Universität Köln Mucl Stamm MU1 G. intraradices Belgien, BCCM/MUCL, S. Declerck Mucl Stamm MU3 G. intraradices Belgien, BCCM/MUCL, S. Declerck INVAM UT126 IV G. intraradices International Culture Collection of Vesicular Arbuscular Mycorrhizal Fungi Mykoplant MP G. intraradices Mykoplant GmbH, Deutschland (bis 2007) Biocontrol Vaminoc BV G. intraradices Biocontrol AG, Schweiz 29

32 2. Materialien und Methoden 2.2 Methoden Sporenisolation aus Blähton Zur Sporenisolation wurde die etablierte Methode der Siebtechnik genutzt. Dazu wurde das Substrat (Blähton) in Wasser gemörsert und über verschiedene Siebe (Maschenweite 120 µm, 45 µm und 35 µm) fraktioniert. Auf diese Weise ließen sich Sporen vor allem im Sieb mit einer Maschengröße von 45 µm anreichern (Abb. 2.2). Suspension der Probe Sporenselektion über Siebe unterschiedlicher Maschenweite Selektion einzelner Sporen Abb. 2.1: Vorgehensweise zur Anreicherung der AM-Pilz-Sporen aus Blähton [22] Sporensterilisation Die isolierten Sporen wurden dreimal in sterilem Wasser gewaschen und unter dem Mikroskop vereinzelt. Nach zehnminütiger Inkubation, mit 2 %igem Chloramin T (plus 2-3 Tropfen Tween 20) wurden die Sporen unter dem Mikroskop dreimal in sterilem Wasser gewaschen. Es folgt eine zehnminütige Inkubation in einer Antibiotikalösung (0,02 % Streptomycin, 0,01 % Gentamycin) mit nachfolgenden drei Waschschritten. Nun konnten die Sporen einzeln auf MSR-Medium ausgelegt und im Dunkeln bei 26 C inkubiert werden. Nach 14 Tagen wurde die Keimung der Sporen mit Hilfe eines Mikroskopes überprüft. Die gekeimten Sporen konnten zur Etablierung einer in vitro Kultur eingesetzt werden. 30

33 2. Materialien und Methoden Herstellung einer transfizierten Daucus carota (Karotte) Wurzelkultur [79] Zur Transfektion wurde eine Daucus carota Linie aus der Genbank des IPK Gatersleben und zwei verschiedene Agrobacterium rhizogenes Stämme A4 (Frankreich, Prof. D. Tepfer) und (Deutschland, Gatersleben, Dr. I. Saalbach), welche für 48 Stunden bei 28 C auf entsprechendem Medium (CPY bei Stamm 15834, MYA bei Stamm A4) vorkultiviert wurden, verwendet. Desinfektion der Daucus carota Linien: Die Karotten wurden gründlich mit Wasser gewaschen, gebürstet, abgeschält und in ca. 5 cm lange Stücke geschnitten. Sie wurden unter sterilen Bedingungen 10 Sekunden in 96 %igen Ethanol getaucht, die Oberfläche 15 Minuten in 1 %iger Natriumhypochlorid-Lösung sterilisiert, 3 x 5 Minuten in sterilem deionisiertem Aqua dest. gewaschen, in ca. 5 mm dicke Scheiben geschnitten und mit dem Wurzelpol (Allorhizie oder Radikula) zum Medium zeigend auf Wasseragar aufgelegt. Transfektion: Die Karottenscheiben wurden auf der zur Wurzelspitze hin zeigenden Seite (distal face) mit je einem der beiden vorkultivierten Agrobacterium rhizogenes Stämme infiziert und bei 26 C im Dunkeln kultiviert. Nach ca. 3 Wochen wurden ein bis zwei cm lange transfizierte Wurzeln, welche an den behandelten Abschnitten wucherten unter sterilen Bedingungen ausgeschnitten, auf Petrischalen mit MSR-Medium (+ 500 mg/l Carbenicillin) aufgelegt und bei 26 C im Dunkeln kultiviert. Nach dreimaliger Subkultur auf antibiotikahaltigem Medium waren die Wurzeln frei von Bakterien. Von der letzten Subkultur wurde eine Wurzelspitze (mindestens 3 cm) steril entnommen, auf MW-Medium aufgelegt und bei 27 C im Brutschrank kultiviert. Test der Linien auf Kolonisierbarkeit mit G. intraradices: Die erhaltenen drei Linien wurde mit G. intraradices als Symbiosepartner auf ihre Tauglichkeit in der in vitro Kultur getestet. Dafür wurde je ein 5 cm langes Wurzelstück eine Woche auf MSR-Medium vorkultiviert und dann mit G. intraradices Sporen infiziert. 31

34 2. Materialien und Methoden Herstellung einer transfizierten Fragaria x Ananassa (Duch.) (Erdbeere) Wurzelkultur [48] Zur Transfektion wurden oktoploide in vitro Fragaria x Ananassa Duch. und zwei verschiedene Agrobacterium rhizogenes Stämme A4 und 15834, welche für 48 Stunden bei 28 C auf entsprechendem Medium vorkultiviert wurden (CPY bei Stamm 15834, MYA bei Stamm A4), verwendet. Desinfektion und Transfektion: Frisch geschnittene Blattstücke wurden in 1:20 verdünntem, flüssigem MS-Medium (ohne Zucker) 30 Minuten langsam geschüttelt, anschließend mit Flüssigmedium gespült, mit sterilem Filterpapier abgetrocknet und auf B5 Medium aufgelegt. Mit einer sterilen Injektionsnadel (0.55 x 25 mm) wurden die Blattstücke durch Punktion des Blattes bzw. Injektion in die Blattrippen mit Agrobacterium rhizogenes infiziert. Zunächst wurde drei Tage bei 21 C kultiviert und dann auf antibiotikahaltiges Medium (Carbenicillin (500 mg/l), Ampicillin (100 mg/l) und Cefotaxim (100 mg/1)) umgesetzt und bei 26 C weiterkultiviert. Nach ca. vier bis sechs Wochen bildeten sich haarige Wurzeln. Diese wurden abgeschnitten und separat auf B5-Medium kultiviert. Um die Bakterien zu entfernen, wurde dem Medium Carbenicillin (500 mg/l), Ampicillin (100 mg/l) und Cefotaxim (100 mg/1) zugesetzt. Dauerkulturen wurden entweder ohne Antibiotika (wenn Bakterien schon vollständig entfernt) oder mit Zusatz von 100mg/l Cefotaxim (Claforan) angelegt. Test der Linien auf Kolonisierbarkeit mit G. intraradices: Die erhaltenen drei Linien wurde mit G. intraradices als Symbiosepartner auf ihre Tauglichkeit in der in vitro Kultur getestet. Dafür wurde je ein 5 cm langes Wurzelstück eine Woche auf MSR-Medium vorkultiviert und dann mit G. intraradices Sporen infiziert Herstellung einer transfizierten Helianthus annuus L. (Sonnenblume) Wurzelkultur Es wurden die folgenden zwei Akzessionen von Helianthus sp. aus der Genbank Gatersleben verwendet. Akz.-Nr: HEL 415 = Helianthus sp. Jaszberenyi Ursprungsland unbekannt (S1) Akz.-Nr: HEL 428 = Helianthus sp. Arielle Ursprungsland unbekannt (S2) 32