Praktikum Molekularbiologie, 5. Semester, BT 12 Martin Sievers, Gottfried Dasen und Tobias Wermelinger RT 418

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1 Praktikum Molekularbiologie, 5. Semester, BT 12 Martin Sievers, Gottfried Dasen und Tobias Wermelinger RT 418 Datum Gruppe Thema I Forensik: PCR und Restriktionsanalyse am Beispiel der ITS-Region der Hefe II Forensik: PCR und Restriktionsanalyse am Beispiel der ITS-Region der Hefe I Real-time PCR: Fleischanalyse II Real-time PCR: Fleischanalyse I mitochondriale DNA, Sequenzierung: Cytb II mitochondriale DNA, Sequenzierung: Cytb I Klonierung und Expression der SOD (Superoxid-Dismutase) in E. coli: TA-cloning Auswertung: DNA-Sequenzierung II Klonierung und Expression der SOD (Superoxid-Dismutase) in E. coli: TA-cloning Auswertung: DNA-Sequenzierung I Klonierung und Expression der SOD Elektroporation: GFP-, puc-vektor blau-weiss-selektion II Klonierung und Expression der SOD Elektroporation: GFP-, puc-vektor blau-weiss-selektion I Klonierung und Expression der SOD: SDS-PAGE Klonierungstrategie: Calcitonin II Klonierung und Expression der SOD: SDS-PAGE Klonierungstrategie: Calcitonin I und II Protokoll der SOD Klonierung und Expression der SOD: bitte Protokoll erstellen

2 PCR: Polymerase Chain Reaction DNA-Restriktionsenzyme Amplifikation der ITS- Regionen von Hefen DNA-Restriktion der PCR-Produkte

3 Ist die? Hefe: Saccharomyces cerevisiae, Hanseniaspora uvarum oder Candida utilis? CCOS 581 CCOS 582 Saccharomyces cerevisiae Hanseniaspora uvarum Candida utilis?

4 «Genes in a bottle»

5 Forensic DNA Fingerprinting Kit

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7 M CS

8 Molekulare Identifizierung Bakterien Hefen Chromosom Plasmid chr. DNA Plasmidprofil Protein-Profil: MALDI-TOF-MS Restriktionsmuster (rep-pcr) Auftrennung von Chromosomen: Pulsed Field Gelelektrophorse Sequenz: 16S rdna, 23S rdna Sequenz: ITS, 18S, 26/28S rdna

9 MALDI-TOF MS spectrum of Pseudomonas aeruginosa Intens. [a.u.] x m/z ICBC, Ivana Kroslakova und Cultue Collection of Switzerland 9

10 Lage der Internal Transcribed Spacer (ITS)-Region bei Hefen 18S rdna ITS 1 5.8S rdna ITS 2 26S rdna 1.8 kb 0.15 kb 3.8 kb

11 rrna-operon, Eukarya DNA ITS1 ITS2 18S rdna 5.8S rdna 28/26S rdna Transkription rrna 18S rrna 5.8S rrna 28/26S rrna

12 Formaldehyd-RNA-Gel von verschiedenen Arten human 28S rrna 26S rrna 18S rrna 23S rrna 16S rrna Qiagen

13 (ITS)-Region bei Hefen 18S rdna ITS 1 5.8S rdna ITS 2 26S rdna Std Std Amplifikation mittels PCR Std TaqI-Verdau des PCR-Produktes

14 PCR: Polymerase Chain Reaction

15 PCR: Polymerase Chain Reaction Angelika Viviani

16 Angelika Viviani

17 Angelika Viviani

18 Isolation chromosomaler DNA als template für die PCR und Generierung eines PCR-Produktes, welches im Agarosegel eine Grösse von 580 bp ergibt

19 5' 3' ATGCCCAGCAGGGACGCTTGGCGAGGTATCAACGGCTACTAA TACGGGTCGTCCCTGCGAACCGCTCCATAGTTGCCGATGATT 3' 5' Denaturierung 3' 5' ATGCCCAGCAGGGACGCTTGGCGAGGTATCAACGGCTACTAA 3' TACGGGTCGTCCCTGCGAACCGCTCCATAGTTGCCGATGATT 5'

20 5' ATGCCCAGCAGGGACGCTTGGCGAGGTATCAACGGCTACTAA 3' 3' TACGGGTCGTCCCTGCGAACCGCTCCATAGTTGCCGATGATT Primer annealing 5' 5' 3' ATGCCCAGCAGGGACGCTTGGCGAGGTATCAACGGCTACTAA forward 5' 3' ATGCCCAGC GCCGATGATT 3' 5' reverse TACGGGTCGTCCCTGCGAACCGCTCCATAGTTGCCGATGATT 3' 5'

21 5' 3' ATGCCCAGCAGGGACGCTTGGCGAGGTATCAACGGCTACTAA GCCGATGATT 5' 3' 3' 5' ATGCCCAGC TACGGGTCGTCCCTGCGAACCGCTCCATAGTTGCCGATGATT 3' 5' Polymerization 5' 3' ATGCCCAGCAGGGACGCTTGGCGAGGTATCAACGGCTACTAA TACGGGTCGTCCCTGCGAACCGCTCCATAGTTGCCGATGATT 3' 5' 5' ATGCCCAGCAGGGACGCTTGGCGAGGTATCAACGGCTACTAA 3' TACGGGTCGTCCCTGCGAACCGCTCCATAGTTGCCGATGATT 3' 5'

22 1993: Nobelpreis für Chemie gemeinsam mit Michael Smith für die Entdeckung der PCR Spektrum der Wissenschaft, Juni 1990

23 Denaturierung DNA-Replikation Primer annealing dntp, DNA- Polymerase Polymerisation PCR dntp, Taq- Polymerase

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25 template 3 -AGC AGA CGG ATG AGT CGG GAT CAG AGA GAT TGC CCG AGG GCA GCA AAT TCG TCT GCC TAC TCA GCC CTA GTC TAT CTA ACG GGC TCC CGT CGT TTA 3 Schritt 1: Denaturierung (95 C): 3 -AGC AGA CGG ATG AGT CGG GAT CAG AGA GAT TGC CCG AGG GCA GCA AAT TCG TCT GCC TAC TCA GCC CTA GTC TAT CTA ACG GGC TCC CGT CGT TTA 3 Schritt 2: Primer Annealing (berechnet nach T m Wert): 3 -AGC AGA CGG ATG AGT CGG GAT CAG AGA GAT TGC CCG AGG GCA GCA AAT TCG TCT GCC TAC TCA GCC CTA GAT TGC CCG AGG GCA GCA AAT 5 35 x 5 -TCG TCT GCC TAC TCA GCC CTA GTC TAT CTA ACG GGC TCC CGT CGT TTA 3 Schritt 3: DNA Synthese durch hitzestabile Polymerase: 3 -AGC AGA CGG ATG AGT CGG GAT CAG AGA GAT TGC CCG AGG GCA GCA AAT TCG TCT GCC TAC TCA GCC CTA GTC ATA GAT TGC CCG AGG GCA GCA AAT TCG TCT GCC TAC TCA GCC CTA GTC TAT CTA ACG GGC TCC CGT CGT TTA 3

26 anfängliche Denaturierung Denaturierung PCR Primer annealing 35 x dntp, DNA- Polymerase Polymerisation final polymerization 8 C 2 35 Kopien

27 PCR Zyklus, Thermoprofil 1 Zyklus der 35 Zyklen Temperatur 95 C Denaturierung 72 C 55 C Polymerisation Primer annealing Zeit

28 PCR-Temperaturprofil 35x 95 C 95 C Temperatur Polymerisation. 2 min anfängliche Denat. 15 min Denat. 30 sec. 55 C Primer annealing 30 sec. 72 C final Polymer. 10 min 8 C Abkühlung hold Zeit

29 Probe Isolierung der DNA PCR Ansatz Reagenzien zur DNA: dntp's (desoxynucleotidtriphosphate) Primer forward Primer reverse Taq-Polymerase Puffer (Mg 2+ ) H 2 O Thermal-Cycler Auswertung kb Agarosegelelektrophorese 1: positiv Kontrolle 2: PCR-Produkt 3: negativ Kontrolle

30 Handling o Einweghandschuhe tragen o nur sterile Pipettenspitzen und PCR Reaktionsgefässe verwenden o Pipettenspitzen mit Filter benutzen (Aerosole) o PCR Reaktionsgefässe richtig beschriften o bei jedem Pipettierschritt neue Spitze verwenden o Pipetierschritt kontrollieren ( l Massstab) o Vermeidung von Kontaminationen: separater Raum, Sterilbanch: Aufarbeitung der Probe: DNA Isolation PCR Kammer: Pipettierung: Primer, dntp's, Polymerase, Puffer und steriles bidest H 2 O separater Bereich: Zugabe der isolierten DNA o stets positiv und negativ Kontrollen mitführen o Angaben der Hersteller beachten

31 PCR-Produkt, Berechnung (PCR-Formel) X n = X 0 2 n X n = Menge des PCR-Produktes nach n Zyklen X 0 = Ausgangsmenge der template DNA n = Anzahl der Zyklen X n = X 0 (1 + E) n Abbildung: Roche: PCR, eine ausgezeichnete Methode X n = Menge des PCR-Produktes nach n Zyklen X 0 = Ausgangsmenge der template DNA E = Effizienz der PCR (Wert zwischen 0 und 1)

32 Denaturierung ersten zwei PCR-Zyklen Primer Annealing Polymerisation Polymerisation Denaturierung 35 Zyklen konstantes Template lineare Zunahme Primer Annealing exponentielle Zunahme

33 Generation of longer PCR products 22 kbp 6.8 kbp DNA: Ixodes ricinus PCR-Produkte: 22 kb (Banden 2-10), Eppendorf PCR: OmpA: R. helvetica Roche PCR-Fragmente: 20 kb PCR-Fragmente: 5 bis 9 kb

34 Amplifikation eines DNA Fragmentes 5' 3' ATGATATGCCCCGCCTCCTAA vorwärts (forward) Länge des Amplifikates reverse 3' 5' Sequenzangabe bei der Bestellung der Primer: 5' 3' Primer (vorwärts): Primer (reverse): Primerlänge als Beispiel: 5 nt

35 Design: PCR-Primer, RT-Primer, Aufgaben o o DNA-Sequenz, Einzelstrang, NCBI-Genbank: SOD, E. coli mrna-sequenz: GFP, Aquorea victoria

36 E. coli: Superoxid-Dismutase: SOD Accession No.: X03951, cds: 141 bis 761: 621 bp

37 SOD, E. coli PCR-Primer, DNA-Sequenz: Primer, forward: Primer, reverse: T m -Wert: Temperatur: Primer annealing:

38 GFP, mrna, Aequorea victoria Accession No.: L b Foto: Prospekt: Bio-Rad augag uaaaggagaa gaacuuuuca cuggaguugu cccaauucuu guugaauuag auggcgaugu uaaugggcaa aaauucucug ucaguggaga gggugaaggu gaugcaacau acggaaaacu uacccuuaaa uuuauuugca cuacugggaa gcuaccuguu ccauggccaa cacuugucac uacuuucucu uaugguguuc aaugcuuuuc aagauaccca gaucauauga aacagcauga cuuuuucaag agugccaugc ccgaagguua uguacaggaa agaacuauau uuuacaaaga ugacgggaac uacaagacac gugcugaagu caaguuugaa ggugauaccc uuguuaauag aaucgaguua aaagguauug auuuuaaaga agauggaaac auucuuggac acaaaaugga auacaacuau aacucacaua auguauacau cauggcagac aaaccaaaga auggaaucaa aguuaacuuc aaaauuagac acaacauuaa agauggaagc guucaauuag cagaccauua ucaacaaaau acuccaauug gcgauggccc uguccuuuua ccagacaacc auuaccuguc cacacaaucu gcccuuucca aagaucccaa cgaaaagaga gaucacauga uccuucuuga guuuguaaca gcugcuggga uuacacaugg cauggaugaa cuauacaaau aa

39 RT-PCR: mrna dscdna mrna 5' 3' AUG UAA

40 GFP, mrna: RT-PCR Foto: Prospekt: Bio-Rad Reverse Transkriptase, Primer, DNA-Sequenz: PCR-Primer, DNA-Sequenz: Primer, forward: Primer, reverse: T m -Wert: Temperatur: Primer annealing: Anzahl zu bestellende Primer für RT-PCR? 2 Primer 3 Primer

41 Use IUB code for mixed base sites: Degenerierte Primer N=G,A,T,C; V=G,A,C; B=G,T,C; H=A,T,C; D=G,A,T; K=G,T; S=G,C; W=A,T; M=A,C; Y=C,T; R=A,G DNA-Sequenz verschiedener Bakterienarten 1. ATG GGC CCA CGC CTC AGT GAA 2. ATG GGC CCA CGC CAC AGT GAA 3. ATG GGT CCG CGC CTC AGT GAA 4. ATG GGT CCG CGC CAC AGT GAA 5. ATG GGC CCA CGC CTC ACT GAA 6. Sequenz nicht bekannt Consensus ATG GGY CCR CGC CWC AST GAA Primer (vor.) ATG GGY CCR CGC CWC AST

42 Bestellung Primer: z.b.: Formular ausfüllen Primer (Oligonukleotide) werden trocken verschickt Produkt 5 Min. bei 65 C in sterilem bidest lösen, zwischendurch vortexen Menge des Primers ist in nmol angegeben Konzentration: nmol/ml (= pmol/ l = M) Primerkonzentration einstellen auf: 100 pmol/ l z.b. Primer: 59 nmol wieviel steriles bidest. H 2 O muss ich zum Primer zugeben, um eine Konzentration von 100 pmol/ l zu haben?

43 5' RACE (rapid amplification of cdna-ends) PCR

44 Herstellung einer DNA-Sequenz mit einer Mutation vorgegebene DNA- Sequenz soll an einer Stelle mutiert werden 1. PCR: vorwärts Primer mit einem Nukleotidaustausch 2. PCR: reverse Primer mit einem Nukleotidaustausch PCR genutzt um die neue DNA-Sequenz mit der Mutation herzustellen DNA-Sequenz mit Punktmutation hergestellt

45 Thr ATG CCG ATA CGA GTG AAC AGC ACA TGG CCA CAG AAG GTA CAT TAA TAC GGC TAT GCT CAC TTG TCG TGT ACC GGT GTC TTC CAT GTA ATT Einfügen einer Mutation in einer DNA- Sequenz mittels PCR Ala ATG CCG ATA CGA GTG AAC AGC GCA TGG CCA CAG AAG GTA CAT TAA TAC GGC TAT GCT CAC TTG TCG CGT ACC GGT GTC TTC CAT GTA ATT 1. PCR ATG CCG ATA CGA GTG AAC AGC ACA TGG CCA CAG AAG GTA CAT TAA TCG CGT ACC GGT ATG CCG ATA TAC GGC TAT GCT CAC TTG TCG TGT ACC GGT GTC TTC CAT GTA ATT 2. PCR ATG CCG ATA CGA GTG AAC AGC ACA TGG CCA CAG AAG GTA CAT TAA CAT GTA ATT AAC AGC GCA TGG TAC GGC TAT GCT CAC TTG TCG TGT ACC GGT GTC TTC CAT GTA ATT

46 1. PCR Produkt: ATG CCG ATA CGA GTG AAC AGC GCA TGG CCA TAC GGC TAT GCT CAC TTG TCG CGT ACC GGT 2. PCR Produkt: AAC AGC GCA TGG CCA CAG AAG GTA CAT TAA TTG TCG CGT ACC GGT GTC TTC CAT GTA ATT PCR, annealing 5' 3' ATG CCG ATA CGA GTG AAC AGC GCA TGG CCA TTG TCG CGT ACC GGT GTC TTC CAT GTA ATT 3' PCR, Polymerisation 5' ATG CCG ATA CGA GTG AAC AGC GCA TGG CCA CAG AAG GTA CAT TAA TAC GGC TAT GCT CAC TTG TCG CGT ACC GGT GTC TTC CAT GTA ATT

47 Biol. Unserer Zeit, 4/2008 (38),Wiley VCH Restriktionsenzyme

48 Restriktion und Modifikation E. coli Robert M. Blumenthal and Xiaodong Cheng, Modern Microbial Genetics, 2002, Wiley-Liss

49 Restriktion und Modifikation von DNA Chemie in unserer Zeit, 1988

50 6nt-Regel beim Schneiden mit Restriktionsenzymen 5' 3' AATTCAGAATTC TTAAGTCTTAAG EcoRI 6nt AATTCAGAATTC TTAAGTCTTAAG GGATCCTATCCT CCTAGGATAGGA BamHI 6nt GGATCCTATCCT CCTAGGATAGGA 3' 5' AATTCAG AATTC G GATCCTATCCT TTAAGTCTTAA G CCTAG GATAGGA

51 PCR-Fragment mit Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme EcoRI cds BamHI 6 nt GAATTC CTTAAG ATG --- TAA TAC --- ATT GGATCC CCTAGG 6 nt EcoRI BamHI EcoRI und BamHI Vektor Vektor

52 PCR Primer mit zusätzlicher Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym am 5'-Ende 3' 3' 5'

53 Konstruktion von PCR-Primer mit Erkennungssequenz für Restriktionsenzyme 5' GAATTC 3' 3' CTTAAG 5' EcoRI 5' GGATCC 3' 3' CCTAGG 5' BamHI Bacillus amyloliquefaciens H am Beispiel der Amplifikation des Oberflächenproteins S vom Hepatitis B-Virus Primer HBsAg+ EcoRI vorwärts: Primer HBsAg + BamHI reverse:

54 Hepatitis B virus S antigen gene, complete cds GenBank: AF cds: 1 bis 681 ATGGAGAACACAGCATCAGGACTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAA AAATCCTCACAATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAACACCCGT GTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCAAATCTCCAGTCACTCACCAACCTGTTGTCCTCCAATTTGTCCT GGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTCTTATCATCTTCCTCTGCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCT TGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCATCAACAACCAG CACCGGACCATGCAAAACCCGCACAACTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCATGTTGCTGTATA AAACCTACGGACGGAAACTGCACCTGTATTCCCATCCCATCATCTTGGGCTTTCGCAAAATACCTATGGG AGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCTTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTC CCCCACTGTCTGGCTTTCAGTTATATGGATGATATGGTTTTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGT CCCTTTATGCCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTGA

55 Konstruktion von PCR-Primer mit Erkennungssequenz für Restriktionsenzyme 5' GAATTC 3' 3' CTTAAG 5' EcoRI 5' GGATCC 3' 3' CCTAGG 5' BamHI am Beispiel der Amplifikation des Oberflächenproteins S vom Hepatitis B-Virus Primer HBsAg+ EcoRI vorwärts: TTGCTTGAATTCATGGAGAACACAGCATCAGGACTCCTAGGACC Primer HBsAg + BamHI reverse: TTCCTTGGATCCTCAAATGTATACCCAAAGACAAAAGAAAATTGG

56 Konstruktion von PCR-Primer mit Erkennungssequenz für Restriktionsenzyme 5' GAATTC 3' 3' CTTAAG 5' EcoRI 5' GGATCC 3' 3' CCTAGG 5' BamHI am Beispiel der Amplifikation des Oberflächenproteins S vom Hepatitis B-Virus Primer HBsAg+ EcoRI vorwärts: TTGCTTGAATTCATGGAGAACACAGCATCAGGACTCCTAGGACC Primer HBsAg + BamHI reverse: TTCCTTGGATCCTCAAATGTATACCCAAAGACAAAAGAAAATTGG

57 PCR-Produkt: Oberflächenprotein S vom Hepatitis B-Virus (HBsAg) mit Erkennungssequenzen für EcoRI und BamHI 6 nt EcoRI cds BamHI 6 nt TTGCTT GAATTC ATGGAG --- ATTTGA GGATCC AAGGAA AACGAA CTTAAG TACCTC --- TAAACT CCTAGG TTCCTT

58 EcoRI und BamHI schneiden nicht in der cds vom Hepatitis B, Oberflächenprotein S!

59 Hallwilersee: Cyanobakterien o Umweltprobe aus dem Hallwilersee o Isolierung Cyanobakterien: Planktothrix rubescens o Identifizierung auf Artniveau o PCR: Gen kodierend für die Gasvakuole: gvpa o Zur Sequenzierung eingesendet zur Firma GATC o Sequenzieung: Barcode-Etikette: Planktothrix rubescens BAFU-Projekt

60 Ergebnis: GATC online: Freitag, , 18:30 Uhr Sequenz: : Ebola-Virus Ebola-Virus identifiziert

61 Warum kein Ebola-Virus: Ebola-Virus nicht endemisch in der Schweiz ausgewählten Primer zur Amplifikation des gvpa-gens hat keine Homologie zu Ebola-Virus-Sequenzen RNA-Virus, wir haben aber DNA isoliert und PCR durchgeführt und nicht RT-PCR

62 GATC hat die Probe vertauscht