Anhang. Bedeutung Bezeichnung Rs + Nukleotidsequenz (5-3 ) Mutationsprimer Asp 29 Glu

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1 AHAG 115 Anhang Tab. 13: Konstruktion der Primer zur Generierung der EcIPDC-Mutanten. Ausgetauschte ukleotide sind unterstrichen. Das ukleotidtriplett, welches für die mutierte Aminosäure codiert, ist hervorgehoben. Die ligonukleotide, synthetisiert durch Invitrogen GmbH (Karlsruhe, Deutschland), wurden so konzipiert, dass zusätzliche Restriktionsschnittstellen (Rs+) eingeführt wurden. Bedeutung Bezeichnung Rs + ukleotidsequenz (5-3 ) Mutationsprimer Asp 9 Glu Glu 5 Asp His 115 Lys Gln 383 Thr Glu 468 Asp Sequenzierprimer EcIPDC/Asp 9 Glu fwd EcIPDC/Asp 9 Glu rwd EcIPDC/Glu 5 Asp fwd EcIPDC/Glu 5 Asp rwd EcIPDC/His 115 Lys fwd EcIPDC/His 115 Lys rwd EcIPDC/Gln 383 Thr fwd EcIPDC/Gln 383 Thr rwd EcIPDC/Glu 468 Asp fwd EcIPDC/Glu 468 Asp rwd Sequ1_381to36_rwd Sequ_63to84_fwd Sequ3_63to65_fwd Sequ4_91to99_fwd Sequ5_15to17_fwd Sequ6_1511to153_fwd Sma1 Bsm1 Sac1 Kpn1 Sal CAT CTG TTT GGC GTG CCC GGG GAG TAT AAC CTG CAG CTG CAG GTT ATA CTC CCC GGG CAC GCC AAA CAG ATG GTG GGC TGT GCC AAT GAC CTG AAT GCA TCC TAT GCC GGC ATA GGA TGC ATT CAG GTC ATT GGC ACA GCC CAC AGG GGA GAG CTC CTG AAG CAT ACG TTG GGG GAT GGG GAG CTC CCC ATC CCC CAA CGT ATG CTT CAG GAG CTC TCC CCT GAC ATT ATC CTT GCC GAC ACG GGT ACC TCG GCC TTC GGC GCC GAA GGC CGA GGT ACC CGT GTC GGC AAG GAT AAT GTC GGT TAC ACG GTC GAC AGA GCT ATC CAC GGG GCG CGC CCC GTG GAT AGC TCT GTC GAC CGT GTA ACC CGT ATG ATG CAG CAA CTC TCC C GGG AGT TAA GTG CCA TGA ACG G TGC TGC TGA GAA CAA ACT GGC GGG TTC ACG CAC CAG CTT AC GGC TCG ATT GGT TAC ACG CTG GCC TCG ATC CTC AGT CTG AGT G

2 AHAG 116 Tab. 14: Sekundärstrukturelemente im EcIPDC-Monomer. Die mit * gekennzeichneten ß-Faltblätter sind antiparallel. Domäne Helix AS-Sequenz ß-Faltblatt PYR α1 6 CVADYLLDRLTDC 18 ß1 α 8 GDY 3 α3 31 LQFLDHVIDS 41 ß α4 51 ELASYAADGYARCKG 67 ß3 α5 76 GVGELSA 8 α6 8 AMGIAGSYAE 9 ß4 α7 14 GTAAQQRG 111 ß5 α8 14 RHFYHMS 13 α9 131 EPIT 134 ß6 α1 144 ACYEIDRVLTTMLRER 16 α ADVAKK 174 AS-Sequenz HLFG 5 45 CWVG AALLTT VLHIVGA AQAV GYLMLP 168 R PP α1 α13 α14 α15 α16 α17 α18 α19 α α1 α α3 α4 α5 α6 α7 α8 191 DSACLKAFRDAAEKLAM 8 17 DFLVLRH 3 5 LKHALQKWVKEV LMGK 47 6 SGSAS TGAVKEAIEG PMQAIETLVELCKQ TQEFWRTLQTFI GTSAFGAI GYTLAAAFGAQTAC DGAAQLTI QELGSMLRD YTVERAIH QRYD WTHI EAEQLADVLEKVA PPLLGALTKALEAC 551 ß7 ß8 ß9 ß1 ß11 * ß1 * ß13 ß14 ß15 ß16 1 TALLA AHAT 4 79 TVLCV TIEV AARV VWFT IILA FI 4 49 VIVLTG IILVL 461 ß SECWRV 54 ß18 53 LSLIEVM 59

3 AHAG 117 Tab. 15: Potentielle Wasserstoffbrücken- und Salzbrückenbindungen im Monomer-Monomer-Interaktionsbereich der EcIPDC. Es sind die Wechselwirkungen zwischen den Untereinheiten A und B dargestellt. Die hervorgehobenen Aminosäuren sind konserviert und am Dimeraufbau der PDC (Zm,Sc) beteiligt. Donor Aminosäure Atom Akzeptor Aminosäure Atom Asp36 D1 Gln476 E D1 Tyr478 H Trp46 Arg477 H1 H Abstand (Ǻ) Asn51 D Leu Glu5 E Leu113 Asp His116 D1 Leu46 Trp Lys173 Z Asn55 Asn551 D Asp89 Leu Leu46 His Trp47 His116 D1.71 Gln439 Gln443 E 3.1 Gln443 E E1 Gln439 Gln443 Gln443 E1 E Gln476 E Asp36 D1.9 Arg477 H1 H Trp46 Trp Tyr478 H Asp36 D1.99 Asn485 Ala Ala49 Asn Asn55 D Lys173 Asp9 Z D Asn551 D1 Lys173 Z.76 1 Glu5 E1.67 Tab. 16: Potentielle Wasserstoffbrückenbindungen im Dimer-Dimer-Interaktionsbereich der EcIPDC. Es sind die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Untereinheiten A und C aufgeführt. Donor Aminosäure Atom Akzeptor Aminosäure Atom Abstand (Ǻ) Cys146 CB SG Thr3 Thr3 Thr3 G1 G1 G Val18 Asp191 D1.59 Asp191 D1 Val18.86 Thr3 G1 Cys146 Cys146 Cys146 CB SG

4 AHAG 118 Tab. 17: Unmittelbare und über Wassermoleküle vermittelte Kontakte der Cofaktoren und Mg + im aktiven Zentrum der EcIPDC (am Bsp. der Untereinheit A). Die markierten Reste sind in den -abhängigen Strukturen hoch konserviert. Die mit (*) markierten Reste stammen von der anderen Untereinheit im funktionellen Dimer. Molekül Atom Abstand (Ǻ) Rest Atom A A 1B B 3B Mg Wasser (19) Wasser (157) Wasser (3) E E1 G1 D D D1 D1 A 3B 1A 1B 1B G Glu468 Ile41 Glu5 * Gly48 Wasser (19) Ala437 Gly436 Mg + Gly464 Wasser (3) Wasser (157) Thr385 Thr385 Asn46 Val467 Thr385 Mg + Thr466 Asn46 Gly464 Asp435 Asn 46 Gly464 Wasser (157) Wasser(3) Gln383 Gly434 Mg + Leu46 Asp435 Wasser (19) Ser386 Gly434 Ser386

5 AHAG 119 (C-H) M (C6'-H) HBz (C6'-H) HBz (Cα-H) (C-H) HBz (C6'-H) HBz (Cα-H) H-MR chemische Verschiebung (ppm) 1. M/(M+HBz) Zeit (s) Abb. 37: Stabilität von -Mandelyl- (M). Es wurde die chemische Stabiliät des intermediär in der EcIPDC/Asp 9 Glu katalysierten Umsetzung von Bf gebildeten M bei 7 C und ph.75 überprüft. Die 1 H-MR chemische Verschiebungen gegenüber C6 -H entsprechen 6.7 ppm für M und 6.61 ppm für HBz. Die Anpassung der Daten erfolgte an die Gleichung y=a e -kt (einfach exponentieller Abfall) mit a=.8 ± und k= ± s -1. Das entspricht einer Halbwertszeit von 37 min.

6 AHAG 1 A B IndL IndHE IndHE kein zoom zoom * H-MR chemische Verschiebung (ppm) H-MR chemische Verschiebung (ppm) 1. IndL/(IndL+IndHE) Zeit (s) Abb. 38: Stabilität von -(-Indolyl-lactyl-)- (IndL). Es wurde die chemische Stabiliät des intermediär in der durch die EcIPDC/Glu 468 Asp katalysierten Umsetzung von IPyr gebildeten IndL bei 7 C und ph.75 überprüft. Die 1 H- MR chemische Verschiebungen gegenüber C6 -H entsprechen 6.8 ppm für IndL und 6.37 ppm für IndHE. Die Anpassung der Daten erfolgte an die Gleichung y=a e -kt (einfach exponentieller Abfall) mit a=.56 ±. 1 - und k=. 1-4 ± s -1. Das entspricht einer Halbwertszeit von 53 min.

7 AHAG 11 Benzyl-Rest meta/para-h ortho-h C6'-H Cα-H relatives Integral Indolyl-Rest C6'-H Cα-H relatives Integral 1 1 (1+1) H-MR-chemische Verschiebung Abb. 39: 1 H-MR-chemische Verschiebungen der kovalenten -Addukte HBz und IndHE. Das Cα-H des IndHE entspricht aufgrund der Kopplung mit der prochiralen Methylengruppe einem Quartett. Zwar interferieren die Protonensignale der aromatischen Substrate (Bf, IPyr) und Produkte (Benzaldehyd, Indolacetaldehyd) mit den aromatischen Protonen der Intermediate HBzTHDP (oben) und IndHE (unten), aber die C6 -H Signale bleiben davon unbeeinflusst und können somit zur quantitativen Auswertung herangezogen werden (HBz: 6.61 ppm, IndHE: 6.37 ppm).

8 AHAG 1 Abb. 4: Abhängigkeit der katalytischen Aktivität der EcIPDC-Varianten von der Substratkonzentration. Zur Bestimmung der kinetischen Konstanten wurden die Messdaten (Kreise) an die Michaelis-Menten-Gleichung (IPyr, Bf) oder an die durch den Term der Substratüberschusshemmung erweiterte Form (Pyr) angepaßt. Die Inserts entsprechen der linearisierten Auftragung nach HAES (193). Asp 9 Glu.8.4 k cat (s -1 ) nicht bestimmt S/v S/v kcat (s -1 ) Glu 5 Asp S/v [S] (µm) S/v S/v [Indolpyruvat] (µm) [Pyruvat] (mm) [Benzoylformiat] (mm)

9 AHAG 13.9 His 115 Lys [S] (µm) Glu 468 Asp k cat (s -1 ) [S] (µm) Gln 383 Thr [S] (µm) [Indolpyruvat] (µm) [Pyruvat] (mm) [Benzoylformiat] (mm)

10 AHAG 14.1 Absorption (366 nm) Abb. 41: Zeit (min) Progresskurve der Umsetzung von Indolpyruvat durch die EcIPDC-Variante Asp 9 Glu. Es wurde ein gekoppelt optischer Test mit Pferdeleber-ADH angewendet. Der Messansatz enthielt.1 M Mes/aH ph 6.5,.8 mm ADH, 1 U/mL Pferdeleber-ADH, 3.6 mm IPyr (unter Berücksichtigung des Tautomerengleichgewichtes) und 5.1 mg/ml EcIPDC Asp 9 Glu (präinkubiert mit 15 mm Cofaktoren). Die Absorptionsänderung wurde bei 366 nm verfolgt. Anstelle einer Absorptionsabnahme (ADH-Verbrauch im Sinne des gekoppelt optischen Tests) wurde diese dargestellte Progresskurve beobachtet. Während dieser Messungen (3 C) wurde eine deutliche Denaturierung des Enzyms festgestellt. Beim Wildtypenzym ist dagegen unter vergleichbaren Bedingungen keine Denaturierung zu beobachten.

11 AHAG 15 Abb. 4: 1 H-MR Spektren zur Bestimmung der Intermediatverteilung in der Umsetzung von Pyruvat. Zur Unterscheidung der kovalent am C-Atom des -Moleküls gebundenen Intermediate dient eine 1 H-MR chemische Verschiebung des C6 -H Singuletts der Aminopyrimidinumgebung (8.1 ppm für, 7.7 ppm für L und 7.33 ppm für HE). Wt Asp 9 Glu Glu 5 Asp Puffer/TCA Puffer/TCA HE Puffer/TCA HE HE H MR chemische Verschiebung (ppm) H MR chemische Verschiebung (ppm) H MR chemische Verschiebung (ppm) 7. His 115 Lys Gln 383 Thr Glu 468 Asp Puffer/TCA HE Puffer/TCA HE Puffer/TCA HETHDP LTHDP L L H MR chemische Verschiebung (ppm) H MR chemische Verschiebung (ppm) H MR chemische Verschiebung (ppm) 7.

12 AHAG 16 Abb. 43: 1 H-MR Spektren zur Bestimmung der Intermediatverteilung in der Umsetzung von Benzoylformiat. Die 1 H-MR chemische Verschiebungen gegenüber C6 -H entsprechen 6.7 ppm für M und 6.61 ppm für HBz. Wt Asp 9 Glu Glu 5 Asp Substrate/Produkte/Puffer (inkl. Ammoniumsulfat) siehe Abb. 37 HBz HBz H-MR-chemische Verschiebung 1 H-MR-chemische Verschiebung His 115 Lys Gln 383 Thr Glu 468 Asp (inkl. Ammoniumsulfat) M HBz M HBz HBz H-MR-chemische Verschiebung 1 H-MR-chemische Verschiebung 1 H-MR-chemische Verschiebung

13 AHAG 17 Abb. 44: 1 H-MR Spektren zur Bestimmung der Intermediatverteilung in der Umsetzung von Indolpyruvat. Die 1 H-MR chemische Verschiebungen gegenüber C6 -H entsprechen 6.8 ppm für IndL und 6.37 ppm für IndHE. Wt Asp 9 Glu Glu 5 Asp IndHe IndHE IndHE H-MR-chemische Verschiebung H-MR-chemische Verschiebung H-MR-chemische Verschiebung 6. His 115 Lys Gln 383 Thr Glu 468 Asp siehe Abb. 38 IndL IndHE IndHE H-MR-chemische Verschiebung H-MR-chemische Verschiebung 6.

14 AHAG 18 Abb. 45: Untersuchung der Umsetzung 4-substituierter Benzoylformiate durch EcIPDC-Wt. Dargestellt ist die Abhängigkeit der katalytischen Aktivität der EcIPDC-Wt von der Konzentration 4-substituierter Benzoylformiate. Zur Bestimmung der kinetischen Konstanten wurden die Messdaten (Kreise) an die Michaelis-Menten-Gleichung angepaßt. Die Inserts entsprechen der linearisierten Auftragung nach HAES (193). 5 k cat (s -1 ) [4-Cl-Benzoylformiat] (mm) [4-Br-Benzoylformiat] (mm) [4-F-Benzoylformiat] (mm) 6 k cat (s -1 ) [4-Ethyl-Benzoylformiat] (mm) [4-Methyl-Benzoylformiat] (mm) [4-Methoxy-Benzoylformiat] (mm)

15 AHAG 19 4-Br-Bf 4-CH 3 -Bf 4-Br-HBz 4-CH 3 -M 4-CH 3 -HBz H-MR-chemische Verschiebung (ppm) H-MR-chemische Verschiebung (ppm) Abb. 46: 1 H-MR-Spektren zur Bestimmung der Intermediatverteilung in der Umsetzung von 4-substituierten Benzoylformiaten durch die EcIPDC. Gezeigt ist die Verteilung der Intermedaite im steady state der Umsetzung von 4-Br-Bf und 4-CH3-Bf durch EcIPDC-Wt. Die 1 H-MR chemische Verschiebungen gegenüber C6 -H entsprechen 6.7 ppm für das M-Analoge und 6.61 ppm für das HBz-Analoge.