Konzept zur Untersuchung von Saatgut auf Anteile gentechnisch veränderter Pflanzen

Transkript

1 Anlage 1 zu TOP 4.3 Konzept zur Untersuchung von Saatgut auf Anteile gentechnisch veränderter Pflanzen Unterausschuss "Methodenentwicklung" des Länderausschusses Gentechnik (LAG) (Stand: Oktober 2003) Inhaltsverzeichnis 1. Grundsätze Zielsetzung 1.2 Arbeitsbereich 1.3 Methoden 2. Auswahl und Umfang der Saatgutproben Probennahme 2.2 Größe der Einsendungsprobe 2.3 Größe der Untersuchungsproben 3. GVP- Saatgut- Analytik Qualitative PCR PCR- Methoden Auswertung und Dokumentation qualitativer PCR- Ergebnisse 3.2 Überprüfung von Schwellenwerten (Subsampling) Prüfung der Untersuchungsprobe auf GVP Prüfung weiterer Schwellenwerte mit Hilfe des Subsampling-Verfahrens Quantitative PCR Stand der Technik in der experimentellen Überwachung Auswertung und Dokumentation quantitativer Messergebnisse Dokumentation von Messergebnissen unterhalb der Erfassungs- bzw. Bestimmungsgrenze 8 4. Schlussbemerkungen 9 5. Glossar 9 6. Literatur 10 Anhänge Anhang 1: Anhang 2: Anhang 3: Anhang 4: Weltweit zugelassene transgene Kulturpflanzen Qualitative PCR- Nachweise Prüfplan für das Subsampling Prüfplan für Quantitative PCR- Nachweise Seite 1 von 11

2 1. Grundsätze 1.1 Zielsetzung Der Unterausschuss "Methodenentwicklung" des LAG schlägt ein bundesweit einheitliches Vorgehen bei der Überwachung von konventionellem Saatgut auf Anteile gentechnisch veränderter Pflanzen (GVP) vor und unterbreitet hiermit ein Konzept für die Untersuchung von Saatgut mit Hilfe von PCR-Methoden sowie für die Auswertung der Daten und die Dokumentation der Ergebnisse. 1.2 Arbeitsbereich Bestandteil dieses Konzepts sind Daten zu weltweit zugelassenen transgenen Kulturpflanzen (Anhang 1), für deren Vollständigkeit und Richtigkeit keine Gewähr übernommen wird. Die Probennahme selbst ist nicht Bestandteil dieses Konzepts; sie sollte nach den anerkannten Grundsätzen der Saatgutverkehrskontrolle erfolgen. Der Zeitpunkt der Probennahme sollte möglichst so frühzeitig gewählt werden, dass die Saatgutanalytik noch vor der Aussaat abgeschlossen ist. 1.3 Methoden Im Anhang 2 dieses Konzepts ist eine Sammlung qualitativer PCR Methoden zusammengestellt, die bereits in amtlichen Ringversuchen validiert wurden oder sich derzeit in der Validierung befinden. Aufgrund der zu erwartenden Einführung von Schwellenwerten für Beimischungen von GVP in Saatgut ist zukünftig die quantitative Bestimmung des GVP- Anteils erforderlich. Daher wird in dem aktuellen Konzept bereits auf diese Anforderung eingegangen. Als quantitatives PCR- Verfahren bietet sich z. B. die Real- Time- PCR an (siehe 3.3). Aber auch qualitative PCR- Nachweise mit entsprechender statistischer Auswertung (Subsampling, siehe 3.2) können zur Bestimmung der Wahrscheinlichkeit, dass ein Schwellenwert unter- oder überschritten ist, herangezogen werden. Seite 2 von 11

3 2. Auswahl und Umfang der Saatgutproben 2.1 Probennahme Die Probennahme sollte gemäß der Praxis der Saatgutverkehrskontrolle [1] erfolgen. Sie wird in der Regel durch amtliche Probennehmer der Saatgutverkehrskontrollstellen durchgeführt. Für die Gewinnung einer repräsentativen Saatgutprobe wurden entsprechende Kriterien zur Erstellung geeigneter Probennahmepläne veröffentlicht [1-7]. Sie sollen gewährleisten, dass Einflüsse durch Inhomogenität der zu untersuchenden Saatgutpartie berücksichtigt werden. 2.2 Größe der Einsendungsprobe 1 Bei der Herstellung von Saatgut wird in der Regel große Sorgfalt darauf verwendet, dass dieses möglichst homogen ist. Neben der kontrollierten Erzeugung führt auch die Saatgutaufbereitung vor dem Vertrieb (Beizen, Pillieren) zu einer weiteren Homogenisierung. Bisher liegen noch keine Daten über die Verteilung von GVP- Verunreinigungen in Saatgutpartien vor. Bis solche Daten vorliegen, soll in diesem Konzept von einer Probe ausgegangen werden, die repräsentativ für die zu untersuchende Partie ist, und in der die GVP- Verunreinigung homogen verteilt ist. Die Einsendungsprobe soll hinreichend Saatgut für die Untersuchung im Labor zur Verfügung stellen (siehe 2.3). Gegebenenfalls sollte genügend Material für eine Nachuntersuchung vorhanden sein. Aus der Einsendungsprobe wird im Überwachungslabor die Untersuchungsprobe 1 gewonnen. Die Einsendungsprobe sollte vor der Gewinnung der Untersuchungsprobe homogenisiert (gemischt) werden. 2.3 Größe der Untersuchungsproben Erfahrungsgemäß liegt die technisch realisierbare Erfassungsgrenze 1 einer GVP- Saatgut- PCR bei ca. 0,1%. Die genauen Erfassungsgrenzen der hier vorgeschlagenen qualitativen PCR- Nachweise (siehe Anhang 2) sowie von Real- Time- PCR- Verfahren müssen jedoch im jeweiligen Untersuchungslabor ermittelt werden. Beispiel: Orientiert man sich an der oben genannten technisch realisierbaren Erfassungsgrenze, sollte die Größe der Untersuchungsprobe so bemessen sein, dass bei einer Vertrauenswahrscheinlichkeit (Confidence Level) von 95% ein GVP- Anteil von mindestens 0,1% in der Probe erfasst werden kann. Für die Berechnung des Umfangs der Proben gilt dann nach [8] mit n = Anzahl der Samen aller analysierten Untersuchungsproben, p = maximaler angenommener GVP- Anteil in der Saatgutpartie und r = Vertrauenswahrscheinlichkeit in %: 1 Siehe Glossar. Seite 3 von 11

4 n = log(1-(r/100))/log(1-(p/100)) Ergebnis: Eine Untersuchungsprobe sollte mindestens 2995 Samen enthalten, um einen GVP- Anteil von 0,1% mit einem Vertrauenswahrscheinlichkeit von 95% zu erfassen. Sollen dagegen mit Hilfe der qualitativen PCR statistische Aussagen darüber getroffen werden, mit welcher Wahrscheinlichkeit ein vorgegebener Schwellenwert unter- oder überschritten wird, kann nach Remund et al. [9], das sogenannte Subsampling angewendet werden. Dazu werden qualitative PCR- Nachweisreaktionen mit mehreren Untersuchungsproben aus einer Einsendungsprobe durchgeführt. Anzahl und Größe der aus einer Einsendungsprobe gewonnenen Untersuchungsproben richten sich dabei nach dem vorgegebenen Schwellenwert (siehe 3.2). 3. GVP- Saatgut- Analytik 3.1 Qualitative PCR PCR- Methoden Aus der Untersuchungsprobe wird durch sorgfältiges Zerkleinern das Saatguthomogenat hergestellt. Davon wird eine Teilmenge in die DNA- Extraktion eingesetzt, die laut laborinterner Methodenvalidierung die Einhaltung der Erfassungsgrenze (z.b. 0,1%) sicherstellt (mindestens zwei DNA- Extraktionen = Doppelbestimmung). Aus der gewonnenen DNA wird schließlich die für die PCR- Reaktion notwendige Menge an DNA eingesetzt, die laut laborinterner Methodenvalidierung die Einhaltung der Erfassungsgrenze sicherstellt. Mehrfachmessungen sind zu empfehlen. Informationen zu den spezifischen qualitativen PCR- Nachweisen (nachweisbare Transgene, Genabschnitte, Primersequenzen, PCR- Parameter) finden sich in Anhang 2. Sie gelten auch für die Anwendung des Subsamplings (siehe 3.2) Auswertung und Dokumentation qualitativer PCR- Ergebnisse Wurde in allen DNA-Extraktionen einer Untersuchungsprobe das entsprechende DNA- Fragment mittels qualitativer PCR nachgewiesen, wird vorgeschlagen, das Ergebnis für die Einsendeprobe entsprechend der folgenden Formulierung anzugeben: DNA- Fragment XY nachgewiesen Erfassungsgrenze der PCR = ZZ % Anzahl Samen in der Untersuchungsprobe = NN Samen Eingesetzte Prüfmethode Wurde das fragliche DNA- Fragment in keiner der DNA- Extraktionen nachgewiesen, wird vorgeschlagen, das Ergebnis für die Einsendeprobe entsprechend der folgenden Formulierung anzugeben: DNA- Fragment XY nicht nachgewiesen Erfassungsgrenze der PCR = ZZ % Anzahl Samen in der Untersuchungsprobe = NN Samen Eingesetzte Prüfmethode Seite 4 von 11

5 Hinweis zur Beurteilung von Messergebnissen: Wurde nur in einer oder einigen DNA- Extraktionen einer Untersuchungsprobe das entsprechende DNA- Fragment mittels qualitativer PCR nachgewiesen, sind die Untersuchungen zu wiederholen und die Ergebnisse gegebenenfalls mit einer anderen Methode auf ihre Reproduzierbarkeit hin zu prüfen. Daran kann sich eine Quantifizierung mittels Real- Time- PCR anschließen. Gegebenenfalls ist die Rückstellprobe der Saatgutverkehrskontrolle zu untersuchen. 3.2 Überprüfung von Schwellenwerten (Subsampling) Neben der Quantifizierung von GVO durch den Einsatz von Real- Time- PCR ist es möglich, durch Unterteilung einer Untersuchungsprobe in mehrere Teilproben und qualitative PCR- Analyse und der Auswertung der Ergebnisse mit statistischen Methoden den GVO- Anteil in der Untersuchungsprobe abzuschätzen. Hierbei wird der Anteil transgener Samen in der Untersuchungsprobe ermittelt, die mindestens eine Kopie des nachzuweisenden Genabschnitts enthalten. Werden qualitative PCR- Nachweisreaktionen (Methoden siehe Anhang 2) mit dem Ziel durchgeführt, einen bestimmten Schwellenwert zu überprüfen, so sind bei positiven Ergebnissen sequenziell weitere kleinere Teilproben aus einer Untersuchungsprobe zu untersuchen (so genanntes Subsampling). Durch die Auswertung der ermittelten Positiv-/ Negativbefunde einer Reihe von Teilproben können nach Remund et al. [9] statistisch gesicherte Aussagen darüber gemacht werden, ob ein vorgegebener GVP- Schwellenwert über- oder unterschritten wird. Die Entwicklung und Auswahl eines effizienten Prüfplans und die Minimierung der zu untersuchenden Subsamples ist dabei u.a. abhängig von der Höhe des einzuhaltenden Schwellenwertes, aber auch von der Größe des Anteils transgener Samen. Dazu muss die Körnerzahl der Teilproben auf den zu überprüfenden Schwellenwert abgestimmt sein (Prüfplan siehe Abbildung im Anhang 3). Zur Ermittlung der erforderlichen Parameter (Samenzahl, Anzahl der zu untersuchenden Teilproben, Bewertung positiver Ergebnisse) kann die Excel-Tabelle SeedCalc3.xls [7] als Hilfsmittel dienen. Die Parameter der hier vorgestellten Beispiele sind mit dieser Tabelle berechnet worden Prüfung der Untersuchungsprobe auf GVP Im ersten Schritt der Untersuchung soll geklärt werden, ob die Probe einen GVP enthält. Geht man von einer Erfassungsgrenze der eingesetzten PCR-Nachweise von 0,1% aus, und nimmt diese als Schwellenwert an, sind Teilproben von höchstens 1000 Samen zu untersuchen. Dieser Ansatz soll sicherstellen, dass ein GVP- Samen in 1000 sicher erkannt wird. Statistisch abgesicherte Ergebnisse lassen sich hierbei durch die Untersuchung von mindestens 3 Teilproben mit je 1000 Samen erzielen (vgl. auch 2.3). Ist in keiner der Teilproben ein GVP nachweisbar, wird der Schwellenwert 0,1% mit einer Sicherheitswahrscheinlichkeit von 95% unterschritten. Bei einer oder mehr GVP- positiven Teilproben sind weitere Untersuchungen erforderlich, um den wahrscheinlichen Gehalt der Probe zu ermitteln. Seite 5 von 11

6 3.2.2 Prüfung weiterer Schwellenwerte mit Hilfe des Subsampling- Verfahrens Ob eine festgestellte Verunreinigung mit GVP weitere Konsequenzen hat, ist davon abhängig, welcher Schwellenwert für diesen GVP gilt. Die Identifizierung des GVP ist deshalb eine Voraussetzung für weitere Maßnahmen. Derzeit existieren in der EU keine Grenzwerte für Saatgut. In der Diskussion sind Werte zwischen 0,1% und 1%. Die folgenden Beispiele sind deshalb nur exemplarisch ausgeführt, um das Prinzip des Vorgehens zu verdeutlichen. Für den konkret zu überprüfenden Schwellenwert müssen die hier genannten Samenzahlen pro Teilprobe neu ermittelt werden [7]. Für die Berechnung der folgenden Werte wurde die Excel-Tabelle Seedcalc3.xls verwendet [7]. Die Größe der Teilproben in den folgenden Tests ist so ausgelegt, dass der damit zu prüfende Schwellenwert mit 95% Wahrscheinlichkeit unterschritten wird, wenn in keiner der 3 Teilproben ein GVP nachweisbar war. Bei einer oder mehr GVP- positiven Teilproben sind weitere Untersuchungen erforderlich um den wahrscheinlichen GVO- Gehalt der Probe zu ermitteln. Beispiele für eine Berechnung mit der Excel-Tabelle SeedCalc3.xls : Schwellenwert 0,3% Mit 3 Teilproben soll die Einhaltung des Schwellenwertes von 0,3% mit einer Vertrauenswahrscheinlichkeit von 95% überprüft werden. Die Zahl der Samen ist so zu variieren, dass die Obergrenze der Verunreinigung 0,3% mit 95%-iger Vertrauenswahrscheinlichkeit nicht überschreitet. Eintragungen in der Tabelle SeedCalc3.xls : # of Seed Pools = 3; # of Seeds per Pool = 330; # Deviant Pools = 0; desired Confidence Level = 95% Ergebnis = Computed % in Sample = 0,00%; Upper Bound of True % Impurity = 0,30 Lower Bound of True % Purity = 99,7 Schwellenwert 0,5% Für die Überprüfung des Schwellenwertes 0,5% sind 3 Teilproben mit je 200 Samen zu untersuchen. Schwellenwert 0,9% Für die Überprüfung des Schwellenwertes 0,9% sind 3 Teilproben mit je 110 Samen zu untersuchen. Bei Bedarf einer genaueren Quantifizierung muss sich eine weitere Eingrenzung des GVO- Gehalts mit dem Subsampling- Verfahren oder, falls verfügbar, einer Real- time- PCR anschließen. Anmerkung: Der zu prüfende Schwellenwert sollte bei der angeforderten Menge der Einsendungsprobe berücksichtigt werden (z.b. Schwellenwert von 0,5% = mind Samen). Seite 6 von 11

7 3.3 Quantitative PCR (Real- time- PCR) Stand der Technik in der experimentellen Überwachung Quantitative PCR- Analysen werden in den Überwachungslaboratorien mit den zur Verfügung stehenden Methoden, Materialien und Geräten nach dem derzeitigen Stand der Technik durchgeführt. Das heißt konkret: Der größte Teil der gentechnischen Überwachungslaboratorien der Länder arbeitet bereits mit entsprechenden Geräten zur Quantifizierung (Real- Time- PCR). Der Unterausschuss "Methodenentwicklung" führt derzeit entsprechende Ringversuche zur quantitativen PCR-Analytik durch und ist in diesem Zusammenhang bemüht, die genauen Anforderungen an das Referenzmaterial zu klären. Mangels verfügbaren Referenzmaterials wird für die Kalibrierung der quantitativen PCR auf nicht zertifiziertes, aber gut charakterisiertes Pflanzenmaterial (z. B. aus Freisetzungen) zurückgegriffen [10]. Abschließende Ergebnisse liegen bisher nicht vor. Mit kommerziell erhältlichen Kits ist zur Zeit eine Quantifizierung der in der EU zugelassenen Maistransformanten Bt176, Bt11, T25 und MON810 möglich. Mit diesen Systemen liegen besonders im Bereich der Lebensmittelüberwachung positive Erfahrungen und z.t. Ringversuchsergebnisse (bisher für RR-Soja und Bt176) vor Auswertung und Dokumentation quantitativer Messergebnisse Der Prüfplan für die Untersuchung von Saatgutproben mit Hilfe der Real- Time- PCR ist in Anhang 4 abgebildet. Bei der Angabe der Messergebnisse aus der Real- Time- PCR muss berücksichtigt werden, dass es sich nur um relative quantitative Messwerte von GVP- Gehalten in den Proben handelt. In der Regel wird gleichzeitig eine speziesspezifische Vergleichsgen- Messung durchgeführt, die der Normalisierung der eingesetzten DNA-Menge dient (Bestimmung der Kopienverhältnisse zwischen Referenzgen und Transgen in der Probe). Bei der Angabe von quantitativen Messergebnissen ist die Messunsicherheit des Messverfahrens zu berücksichtigen. Diese setzt sich zusammen aus der Messunsicherheit der Messmethode und der Messunsicherheit, die durch die Anzahl der untersuchten Samen bestimmt wird. Für die Messunsicherheit U 1 der Messmethode gilt nach [11] : U 1 = t * SD * 100 Mittelwert * % n (SD = Standardabweichung, n = Anzahl der Messwerte, t= Wert für n-1 aus der t-tabelle) Seite 7 von 11

8 Für die Messunsicherheit U 2, die durch die Anzahl der untersuchten Samen verursacht wird, gilt modifiziert nach [12]: U = 1 + n * V n * V *100 % (n = Anzahl der untersuchten Samen, V = Verunreinigungsgrad als Dezimalzahl) Mit Hilfe dieser Zusammenhänge kann die Gesamt-Messunsicherheit U ges eines Messergebnisses angegeben werden: U ges. = 2 U + 1 U 2 2 (U 1 = Messunsicherheit der Messmethode, U 2 = Messunsicherheit, die durch die Anzahl der untersuchten Samen verursacht wird) Beispiel: Für eine Untersuchungsprobe von 3000 Samen mit einer gemessenen Verunreinigung von 1% und einer Messunsicherheit der Messmethode von 20% ergibt sich eine Messunsicherheit, die durch die Samenanzahl verursacht wird, von 22% und damit eine Gesamtmessunsicherheit von 30%. Es wird vorgeschlagen, bei der Dokumentation von quantitativen Messergebnissen den Vertrauensbereich des Messergebnisses einschließlich der entsprechenden Vertrauenswahrscheinlichkeit anzugeben, der die oben beschriebene Gesamtmessunsicherheit berücksichtigt. Es wird vorgeschlagen, das Ergebnis entsprechend der folgenden Formulierung für jeden Parameter anzugeben: Bei der Annahme, dass das Referenzgen und das nachgewiesene Transgen im Verhältnis von A:B vorliegen, ergibt sich ein Transgen- Gehalt von XX%. Vertrauensbereich 1 (Vertrauenswahrscheinlichkeit = 95%); Bestimmungsgrenze 1 der PCR = ZZ % Anzahl Samen in der Untersuchungsprobe = NN Samen. Eingesetzte Prüfmethode Dokumentation von Messergebnissen unterhalb der Erfassungs- bzw. Bestimmungsgrenze Die Bestimmungsgrenze wurde z. B. bei Hübner et al. [12] theoretisch und anhand experimenteller Daten für die jeweiligen Pflanzenarten abgeleitet. Es ist erforderlich, laborspezifische Bestimmungsgrenzen zu ermitteln und für die jeweilige Messung anzugeben. 1 Siehe Glossar. Seite 8 von 11

9 Liegt ein Messergebnis im Bereich zwischen Bestimmungs- und Erfassungsgrenze, wird folgende Formulierung vorgeschlagen: DNA- Fragment nachgewiesen; Ergebnis unterhalb der Bestimmungsgrenze von ZZ% Der Gehalt der Verunreinigung ist niedrig und kann nach dem derzeitigen Stand der Technik nicht quantifiziert werden. Anzahl Samen in der Untersuchungsprobe = NN Samen. Eingesetzte Prüfmethode Liegt ein Messergebnis unterhalb der Erfassungsgrenze, wird folgende Formulierung vorgeschlagen: Ergebnis unterhalb der Erfassungsgrenze von YY % Anzahl Samen in der Untersuchungsprobe = NN Samen. Eingesetzte Prüfmethode 4. Schlussbemerkungen In begründeten Einzelfällen können Nachweise von GVP in Saatgut mit anderen als den hier angegebenen PCR-Methoden vorgenommen werden, sofern die Gleichwertigkeit nachgewiesen werden kann. Im Falle eines positiven Befundes (GVP- Nachweis) ist mit dem Auftraggeber zu klären, ob das Ergebnis von einem zweiten Labor bestätigt werden soll. Der Unterausschuss "Methodenentwicklung" schlägt dem Länderausschuss Gentechnik (LAG) vor, das vorliegende "Konzept zur Untersuchung von Saatgut auf Anteile gentechnisch veränderter Pflanzen " den Ländern als Handlungskonzept zu empfehlen. Das vorliegende Konzept wird durch den Unterausschuss "Methodenentwicklung" des LAG ständig entsprechend dem Stand der Wissenschaft und Technik weiterentwickelt. 5. Glossar: Einsendungsprobe: Saatgutprobe, die zur Untersuchung eingesendet wird. Untersuchungsprobe: Teil der Einsendungsprobe, der als Einheit in der Laboruntersuchung analysiert wird. Vertrauensbereich: Wertebereich, innerhalb dessen der Bezugswert mit einer vorgegebenen Vertrauenswahrscheinlichkeit (meist 95%) liegt (Definition in Anlehnung an [11]). Erfassungsgrenze (limit of detection): derjenige kleinste Gehalt eines Analyten in einer Probe, der mit hoher vorgegebener Wahrscheinlichkeit (meist P = 95 %) nachgewiesen werden kann (Definition in Anlehnung an [11]). Bestimmungsgrenze (limit of quantification): Konzentrationswert bei dem der relative Fehler erstmals eine vorgegebene Schranke (üblicherweise 33 %) unterschreitet (Definition in Anlehnung an [11]). Die Bestimmungsgrenze entspricht dem niedrigsten Analytengehalt, der mit einer vorgegebenen Präzision quantifiziert werden kann, sie stellt eine erweiterte Messsicherheit dar. Seite 9 von 11

10 6. Literatur [1] Probenehmer-Richtlinie der Arbeitsgemeinschaft der Anerkennungsstellen für landwirtschaftliches Saat- und Pflanzgut (2001) Hrsg.:Thüringer Landesanstalt für Landwirtschaft [2] Kruse, M.: Probenahmepläne zur Nachprüfung der Verunreinigung von konventionellem Saatgut mit GVO Saatgut. VDLUFA-Schriftenreihe 57, Teil 2: (2001) [3] pr EN ISO Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Sampling (ISO/DIS 21568:2003) [4] Whitaker, T., Freese, L., Giesbrecht, F. and Slate, A.: Sampling Grain Shipments To Detect Genetically Modified Seed. Journal of AOAC International 84: (2001) [5] Lischer, P.: Sampling Procedures to Determine the Proportion of Genetically Modified Organisms in Raw Materials. Part I: Correct Sampling, Good Sampling Practice. Mitt. Lebensm. Hyg. 92: (2001) [6] Lischer, P.: Sampling Procedures to Determine the Proportion of Genetically Modified Organisms in Raw Materials. Part II: Sampling from Batches of Grain Mitt. Lebensm. Hyg. 92: (2001) [7] ISTA (International Seed Testing Association): [8] [9] Remund, K., Dixon, D., Wright, D. and Holden L.: Statistical considerations in seed purity testing for transgenic traits Seed Science Research 11, (2001) [10] Zeitler, R., Pietsch, K., Waiblinger, H.-U.: Validation of real-time PCR methods for the quantification of transgenic contaminations in rape seed Eur Food Res Technol 214: (2002) [11] Kromidas, S.: Validierung in der Analytik, Wiley-VCH, Weinheim (1999) [12] Hübner, P., Waiblinger, H.-U., Pietsch, K. and P. Brodmann: Validation of PCR Methods for Quantitation of Genetically Modified Plants in Food. Journal of AOAC International 84: (2001) Seite 10 von 11

11 [13] Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach 35 LMBG; Verfahren zur Probenahme und Untersuchung von Lebensmitteln, Tabakerzeugnissen, kosmetischen Mitteln und Bedarfsgegenständen BgVV. Loseblattsammlung (Beuth Verlag GmbH, Berlin, Köln) [14] Vollenhofer et al.; In: BgVV- Hefte 05/1999: [15] Allmann et al. (1993), PCR - a possible alternative to immunochemical methods assuring safety and quality of food: Detection of wheat contamination in non-wheat food products. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 196: [16] Tätigkeitsberichte (2002): Drei Nachweismethoden für transgene Pflanzen; Bericht des Unterausschusses Methodenentwicklung des Länderausschusses Gentechnik Bundesgesundheitsblatt 45: [17] Hess N., Ulrich A., Hoffmann T. (2002): Insertionsspezifische Nachweisverfahren für transgene Pflanzenlinien unter Anwendung der inversen PCR. Bundesgesundheitsblatt 45: siehe auch: Methodensammlung des Unterausschusses "Methodenentwicklung" des Länderausschusses Gentechnik (LAG) auf dem Server des Robert- Koch- Instituts (RKI): Seite 11 von 11

12 Anhang 1: Weltweit zugelassene transgene Kulturpflanzen (Stand: August 2001) Raps Handelsnamen Firma Zulassung Phänotypen bzw. eingeführte Genkonstrukte HCN28, T45, Liberty Link Elter für: SW02631, HCN35, SWA2659, SWB2696LL, SW02627 (evtl. alle mit HCN92!) Sorten: 2631LL, EXCEED, SWALLOW, SW Flare LL, SW Legion LL (evtl. alle mit HCN92) HCN92, Topas 19/2 (poca18/ac) Elter für: HCN10, HCN14 Sorten: Independence (HCN10), Innovator (HCN92), HCN14 Falcon GS40/90 (phoe6/ac) Elter für: Avalon GS40/90 (1 Kopie pat!) Liberator C6/Ac (event 8/92-01) (phoe6/ac) Aventis Aventis USA (kein Anbau), CAN, J (EU) (kein Anbau), USA, CAN, J BASTA - Resistenz: p35s - pat - T35S (1 Kopie) InfoAgBiotech Cdn. DD96-11, Variety Registration Office - Cdn, MAFF (Japan) BASTA - Resistenz: p35s(synth.) - pat - T35S; pnos - nptii - 3 ocs integriert: 2 x pat, nur T-DNA Variety Registration Office - Cdn, 98/291/EC (L131/26) Aventis Antrag EU BASTA - Resistenz: p35s - pat (mod.) - T35S (2 Kopien) FS-Antragsunterlagen (RKI ) Aventis Antrag EU BASTA - Resistenz: p35s - pat (mod.) - T35S (1 Kopie) FS-Antragsunterlagen (RKI ) MS1Bn (B91-4) x RF1Bn (B93-101) (pttm8re in MS1, ptve74re in RF1) Elter für: Phy14, Phy31, Phy35, PGS1 MS1Bn (B91-4) x RF2Bn (B94-2) (pttm8re in MS1, ptve74re in RF2) Elter für: Phy23, Phy36, PGS2 MS8Bn (DBN ) x RF3Bn (DBN ) (SeedLink?) (pthw107 in MS8, pthw118 in RF3) Linien: PHS97-515, -579; PHS98-684, -640, -639, PGS EU, CAN, J BASTA - Resistenz/ männl. Sterilität: pta29 - barnase/barstar - 3 nos; pssuara -CTP - bar - 3 g7; pnos - nptii - 3 ocs (1 Kopie) Vertrauliche Unterlagen IV-Antrag, Variety Registration Office - Cdn, OECD, MAFF (Japan) PGS EU, CAN, J BASTA - Resistenz/ männl. Sterilität: pta29 - barnase/barstar - 3 nos; pssuara -CTP - bar - 3 g7; pnos - nptii - 3 ocs (1 Kopie) Vertrauliche Unterlagen IV-Antrag, Variety Registration Office - Cdn, OECD, MAFF (Japan) Aventis USA, CAN, J,. Antrag EU BASTA - Resistenz/ männl. Sterilität: pta29 - barnase/barstar - 3 nos (part.); pssuara -CTP - bar ( )- 3 g7; (1 Kopie) integriert: in MS8 = 1 Kopie T-DNA, in RF3 = 1 Kopie T-DNA rearranged mit 1 deletierten Kopie (P-SsuAra nichtfunktionell) FS-Antragsunterlagen (RKI ) Variety Registration Office - Cdn, MAFF (Japan) PHY 14, PHY 35 PGS Japan BASTA - Resistenz/ männl. Sterilität: pta29 - barnase/barstar - 3 nos; Quellen: u. a. und und

13 Nachkommen von MS1xRF1 PHY 36 Nachkommen von MS1xRF2 pcgn /86-18 (T1); pcgn /86-23 (T1) (pcgn3828) pssuara -CTP - bar - 3 g7; PGS Japan BASTA - Resistenz/ männl. Sterilität: pta29 - barnase/barstar - 3 nos; pssuara -CTP - bar - 3 g7; Calgene USA Fettsäuren verändert: seed-specific promotor (P-Napingen (B.rapa)) - ACP thioesterase 3`-Napingen (B.rapa); p35s - nptii - 3 tml (-23: 15 Kopien an 5 Insertionsorten) USDA/APHIS Appl.-No.: Laurical (pcgn 3828) (T6); (T5) Calgene CAN Fettsäuren verändert: seed-specific promotor (P-Napingen (B.rapa)) - CTP (60 AS) - ACP thioesterase - 3`-Napingen (B.rapa); p35s - nptii - 3 tml (T5: 4-6 Kopien, stabil) InfoAgBiotech Cdn. DD96-08, Agbios (GMO-database) OXY-235 Rhone Poulenc CAN, J Oxynil- Resistenz: bnx (Nitrilase- Gen) aus Klebsiella pneumoniae (1 Kopie) Sorten: 295BX, Armor BX, Cartier BX, Zodiac BX GT73, RT73 (Roundup Ready) (pmon 17237) Monsanto USA, CAN, J, MEX InfoAgBiotech Cdn. DD98-25, Variety Registration Office - Cdn, MAFF (Japan), Agbios Roundup - Resistenz: pcmovb (35S) - CTP1/GOX v247 - E9 3 ; pcmovb (35S)- CTP2/CP4syn (AEPSPS) - E9 3 (1 Kopie) Sorten: Canterra1867, Conquest, DS-Roughrider, Heritage, Hylite225RR, IMC106RR, Hyola357RR, Hyola454RR, LG Dawn, Quest, SWARROW, SWRideR, SW RazoR, SW WaRRior, ZSN700RR, RR Champion GT200 (Roundup Ready ) (pmon 17209) Brassica rapa (Rübsen) HCR-1 Brassica rapa (Rübsen) ZSR500, ZSR502, ZSR503 FS-Antragsunterlagen (RKI ), Variety Registration Office - Cdn, OECD, MAFF (Japan) Monsanto CAN Roundup - Resistenz: pcmovb (35S)- CTP1/GOXsyn - E9 3 ; pcmovb (35S)- CTP2/CP4syn (AEPSPS) - E9 3 (1 Kopie) FS-Antragsunterlagen (RKI ) Aventis CAN Kreuzung mit T45 Monsanto CAN InfoAgBiotech Cdn. DD98-28 Kreuzung mit GT73 InfoAgBiotech Cdn. DD98-21 Mais Quellen: u. a. und und

14 Handelsnamen Firma Zulassung Phänotypen bzw. eingeführte Genkonstrukte LibertyLink, T14 (puc/ Ac) Aventis CAN, USA, ARG, J BASTA - Resistenz: p35s - pat (syn) - T35S (3 Kopien) Fragmente des bla- Gens und lacz- Gens aus puc18 LibertyLink, T25 (puc/ Ac) Aventis USA, CAN, ARG, J, CH, EU InfoAgBiotech Cdn. DD95-22, MAFF (Japan) USDA/APHIS Appl.-No.: , FS-Unterlagen (RKI ) BASTA - Resistenz: p35s - pat (syn) - T35S (1 Kopie) Fragmente des bla- Gens und lacz- Gens aus puc18 MS3 InVigor MS6 InVigor CBH-351 (StarLink) (prva pde110) MON (PV-ZMBK07 + PV-ZMGT10) MON802, YieldGard (PV-ZMBK15 + PV-ZMGT03) MON809 (PV-ZMBK07 + PV-ZMGT10) MON810 MaisGard, YieldGard (PV-ZMBK07) NK603 Roundup Ready InfoAgBiotech Cdn. DD95-22, MAFF (Japan) USDA/APHIS Appl.-No.: , OECD, FS-Unterlagen (RKI /62 PGS CAN, USA BASTA - Resistenz / männl. Sterilität: p35s - bar - 3`nos; pta29 - barnase -?; barstar (partiell); bakt. Promotor - bla- Gen (puc18) (3 Kopien an 1 Insertionsort) InfoAgBiotech Cdn. DD95-16, USDA/APHIS Appl.-No.: , Agbios (GMO-database) Aventis USA BASTA - Resistenz / männl. Sterilität: p35s - bar - 3`nos; PCA55 (pollenspezif.prom.aus Mais) - barnase - 3 nos (trunkiert); USDA/APHIS Appl.-No.: Aventis USA BASTA - Resistenz: p35s - bar - 3 nos (> 4 Kopien); bakt. Promotor - bla- Gen Lepidoptera- Resistenz: p35s - Petunia- cab22l- CTP - Cry9C(mod) - T35S (> 1 Kopie) USDA/APHIS Appl.-No.: , US-Patent 5,994,526 (1999) Monsanto USA Insektenresistenz: pe35s - cryia(b) - 3`nos / Roundup - Resistenz: CP4.EPSPS, GOX, nptii Monsanto USA, CAN Insektenresistenz: pe35s - hsp70-intron - cryia(b) - 3`nos (1 Kopie); nptii- Gen (2 Kopien) Roundup - Resistenz: p35s - hsp70-intron - AEPSPS/CTP2 - CP4 (1 Kopie); CTP1 - GOX (2 Kopien) InfoAgBiotech Cdn. DD95-26, USDA/APHIS Appl.-No.: Pioneer CAN, USA Insektenresistenz: pe35s - hsp70-intron - cryia(b) - 3`nos (1 vollst. + 1 partielle Kopie) Antrag EU Roundup - Resistenz: pe35s - hsp70-intron - AEPSPS/CTP2 - CP4-3`nos (2 Kopien); - P35S - hsp70-intron - CTP1 - GOXv247 (part.) Monsanto USA, CAN, EU, ARG, J, CH, Südafrika InfoAgBiotech Cdn. DD95-18, IV-Unterlagen zu MON810 (RKI ) Insektenresistenz: pe35s - cornhsp70 intron - cryia(b) (verkürzt) (1 Kopie) InfoAgBiotech Cdn. DD95-19, MAFF (Japan) USDA/APHIS Appl.-No.: , IV-Unterlagen (RKI ), OECD Monsanto USA Roundup - Resistenz: pactin1/act1-intron (Oryza) -CTP2-CP4.EPSPS-3`nos pe35s - cornhsp70 intron - CTP2 CP4.EPSPS - 3 nos (1 Kopie) Quellen: u. a. und und

15 (PV-ZMGT32) B 16, DLL25 (pdpg165) DBT418 Bt Xtra (pdpg699, pdpg165, pdpg320) 676, 678, 680 (DP5814) Bt 176, Event 176, Maximizer, NatureGard, KnockOut (pcib pcib4431) Bt 11, SandozSeeds (pzo1502) USDA/APHIS Appl.-No.: , FS-Unterlagen (RKI ) DeKalb USA, CAN, J BASTA - Resistenz: p35s bar(syn) - T7 3 / bla- Gen (puc18) (1 Kopie = ges.plasmid) DeKalb USA, CAN, ARG, J, EU - zurückgezogen InfoAgBiotech Cdn. DD95-15, MAFF (Japan), USDA/APHIS Appl.-No.: BASTA - Resistenz: p35s - bar - T7 3 / bla- Gen (puc18) (2 Kopien bar, eine rearrang.) Insektenresistenz: p35s - Intron VIadh1 - cryia(c) - 3 potato pinii (5 Kop. bla, 2 Kop. cry) InfoAgBiotech Cdn. DD95-23, MAFF (Japan), USDA/APHIS Appl.-No.: Pioneer USA BASTA - Resistenz: pe35s - TMV-leader - ADH-Intron I - bar - T-pinII männl. Sterilität: Gewebespezif.Promotor P DNA adenine methylase (aus E. coli) - T-pinII USDA/APHIS Appl.-No.: , US-Patent 5,689,051 Novartis, Ciba-Geigy Northup King USA, EU, CAN, J, ARG, CH USA, EU (kein Anbau), CAN, J BASTA - Resistenz: p35s - bar- T35S / bla- Gen (2 Kopien) Insektenresistenz: pcdpk - cryia(b) - PEPC intron - T35S ppepc - cryia(b) - PEPC intron - T35S InfoAgBiotech Cdn. DD95-09, MAFF (Japan) USDA/APHIS Appl.-No.: , OECD, IV-Unterlagen (RKI ) BASTA - Resistenz: p35s - adh 1S-Intron2 (IVS2) - pat - 3 nos Insektenresistenz: p35s - adh 1S-Intron6 (IVS6) - cryia(b) - 3`nos (1 Kopie) Linien (CAN): X4334 CBR, X4734 CBR GA 21 RoundupReady (pdpg434;3,4 kb NotI-Fragment) MON832 (PV-ZMBK07 und PV-ZMGT10) MON863 (ZMIR13L) Line 1507 (PHP12537) Monsanto Monsanto USA, CAN, ARG Antrag EU, J CAN (nur Food, Anbau zurückgezogen) InfoAgBiotech Cdn. DD95-12, MAFF (Japan), USDA/APHIS Appl.-No.: , NF- Unterlagen (RKI /29), OECD Roundup - Resistenz: pactin 1 (Oryza) - CTP (Helianth./Zea) - act-intron I - mepsps (Zea) - 3 nos (2 Kopien und 3. Kopie ohne 3 nos an 1 Insertionsort) InfoAgBiotech Cdn. DD99-33, MAFF (Japan), USDA/APHIS Appl.-No.: , FS- Unterlagen (RKI ), OECD Roundup - Resistenz: EPSPS (CP4), GOXv247, bakt. Promotor - nptii (3 nos??) InfoAgBiotech, Health Cdn. Monsanto USA - i.v. Insektenresistenz: Cry3Bb (corn root worm resistance) Mycogen c/o Dow & Pioneer USA - i.v. USDA/APHIS Appl.-No.: , Federal Register: fr19mr01-64 Insektenresistenz: Cry1F USDA/APHIS Appl.-No.: , Fed. Register: fr07mr01-63 MON810 x T25 Pioneer Antrag EU Insektenresistenz: pe35s - cornhsp70 intron - cryia(b) - 3`nos BASTA - Resistenz: p35s - pat (syn) - T35S Fragmente des bla- Gens und lacz- Gens aus puc18 ( je 1 Kopie) Quellen: u. a. und und

16 Kartoffel Handelsnamen Firma Zulassung Phänotypen bzw. eingeführte Genkonstrukte tbk50-13 ("Apriori"), tbk50-66 ("Apropos") (PKGBA50 (pbin19-derivat)) Avebe Antrag EU (zurückgezogen) Veränderung der Stärkezusammensetzung: oriv, insb, nptiii, trfa,m13ori, nos3`, GBSS- Gen in antisense, pgbss-gen, npt II- Gen, pnos, ColE1, tetr, traj (vollst.vektor integriert: 4 (Apriori) bzw. 6 Kopien (Apropos)) Opinion Scientific Committee on Plants (C/NL/96/10) IEH Fa. Amylogene EU - i.v. pgbss-gen - GBSS-Gen in antisense - nos3`, pnos - nptii - nos3` DETR (UK) "Russet Burbank New Leaf" Bt6, Bt 10, B12, Bt 16, Bt17, Bt23 (PV-STBT02) Monsanto USA, CAN, (J) Coleoptera- Resistenz: pe35s (2x) - CryIIIAsyn (tlw.delet) - E9 3 p35s - nptii - 3 nos Bt6, B12, Bt17, Bt23 ( je 1 Kopie) Bt 10, Bt 16 (je 2 Kopien) InfoAgBiotech Cdn. DD96-06, MAFF (J), OECD, USDA/APHIS Appl.-No.: , "Superior New Leaf" SPBT02 (PV-STBT02) Linien: SPBT02-5, SPBT02-7 "Atlantic New Leaf" ATBT04 (PV-STBT04) Linien: ATBT04-6, ATBT04-27, ATBT04-30, ATBT04-31, ATBT04-36 Agbios (GMO-database) Monsanto USA, CAN Kartoffelkäfer (Colorado potato beetle, CPB) - Resistenz: CryIIIA- Gen; nptii- Gen InfoAgBiotech Cdn. DD97-20, USDA/APHIS Appl.-No.: , Agbios (GMO-database) Monsanto USA, CAN Coleoptera- Resistenz: p-ats1a - synth.cryiiia - T-E9, P35S - nptii - nos3` integriert: 3 Inserts in ATBT04-6, 1 Insert in ATBT04-30 u. ATBT04-31, 2 Inserts (je 1 Kopie) in ATBT Kopie mit part. CryIIIA-Kopie und Streptomycin-Resistenzgen, 3 Inserts in ATBT04-36 (1 Kopie mit vollständigem Plasmid) InfoAgBiotech Cdn. DD97-20, USDA/APHIS Appl.-No.: , Agbios (GMO-database) " Russet Burbank New Leaf Plus" RBMT21; RBMT22 Linien: RBMT21-129, RBMT21-152, RBMT21-350, RBMT22-82, RBMT22-186, RBMT22-238, RBMT "Russet Burbank New Leaf Y" RBMT15 (PV-STMT15) Linie: RBMT Monsanto USA, CAN Potato Leaf Roll Virus- Resistenz: pfmv - PLRV-replicase (ORF1)+PLRV-helicase (ORF2) CPB- Resistenz: CryIIIAsyn- Gen / pnos - nptii- 3 nos 2 A.tumefaciens-Vektoren/ events, nptii evtl. nur in RBMT21-Linien, zusätzl. CP4 EPSPS in RBMT22-Linien InfoAgBiotech Cdn. DD in progress, USDA/APHIS Appl.-No.: , Agbios (GMOdatabase) Monsanto USA, CAN Potato Virus Y- Resistenz: pfmv - Hsp17.9 (soy)-leader - cp (PVY) - E9 3 CPB- Resistenz: pssuara - CryIIIAsyn - 3 nos ; pnos - nptii - 3 nos InfoAgBiotech Cdn. DD in progress,usda/aphis Appl.-No.: , Agbios (GMOdatabase) "Shepody New Leaf Y" Monsanto USA Potato Virus Y- Resistenz: pfmv - Hsp17.9 (soy)-leader - cp (PVY) - E9 3 Quellen: u. a. und und

17 SEMT15 (PV-STMT15) Linien: SEMT15-02, SEMT15-15 "Hi-Lite New Leaf Y" HLMT15-46 (PV-STMT15) CPB- Resistenz: pssuara - CryIIIAsyn - 3 nos ; pnos - nptii - 3 nos bakt. Promotor - aad- Gen (E. coli); oriv (RK2), ori322 InfoAgBiotech Cdn. DD in progress,usda/aphis Appl.-No.: , Agbios (GMOdatabase) Monsanto USA Potato Virus Y- Resistenz: pfmv - Hsp17.9 (soy)-leader - cp (PVY) - E9 3 CPB- Resistenz: pssuara - CryIIIAsyn - 3 nos ; pnos - nptii - 3 nos bakt. Promotor - aad- Gen (E. coli) InfoAgBiotech Cdn. DD in progress,usda/aphis Appl.-No.: , Agbios (GMOdatabase) Rüben Handelsnamen Firma Zulassung Phänotypen bzw. eingeführte Genkonstrukte T120-7 (poca18 / Ac-) Liberty Link T252 (phoe6 / Ac-) H7-1 (pmon 17227) # 77 (pmon17204) Aventis USA, CAN, J BASTA - Resistenz: p35s - pat (syn) - T35S; pnos - nptii - 3`ocs pian7 (E. coli) (1 Kopie) USDA/APHIS Appl.-No.: , FS-Unterlagen (RKI ) Aventis Freisetzungen BASTA - Resistenz: p35s - pat (syn) - T35S Monsanto Freisetzungen Roundup - Resistenz: pfmv - AEPSPS.CTP2 - CP4syn - E9 3 FS-Unterlagen (RKI ) Syngenta Freisetzungen Roundup - Resistenz: pfmv - AEPSPS.CTP2/CP4syn - E9 3 ; Seeds pe35s - uida - E9 3` - P-CMoVb - CTP1 - GOX(unvollst.) möglw. identisch mit GTSB77 # 203 (pmon17209) GTSB77, InVigor Syngenta Seeds Syngenta Seeds USDA/APHIS Appl.-No.: , FS-Unterlagen (RKI ) Freisetzungen Roundup - Resistenz: pfmv - CTP1/GOXsyn - E9 3 ; pfmv - AEPSPS.CTP2/CP4syn - E9 3 USDA/APHIS Appl.-No.: , FS-Unterlagen (RKI ) USA Roundup - Resistenz: pfmv - CTP2/GOXv247 -? ; pfmv - AEPSPS.CTP2/CP4 - E9 3 p35s - uida - E9 3 möglw. identisch mit # 77 A5/115 (Futterrübe) (pmon17204) USDA/APHIS Appl.-No.: , FS-Unterlagen (RKI ) Trifolium (DK) Antrag EU Glyphosate- Resistenz: pcmovb - CTP2/CP4-EPSPSsyn - E9 3` (1 Kopie) DETR (UK), Opinion Scientific Committee on Plants (C/DK/97/01) Soja Quellen: u. a. und und

18 Handelsnamen Firma Zulassung Phänotypen bzw. eingeführte Genkonstrukte GTS (Roundup Ready) (PV-GMGT04) Monsanto USA, EU, CAN, J, ARG, MEX Roundup - Resistenz: pe35s- CTP1 - CP4orig. EPSPS - 3`nos (1 Kopie) A2704, A (pwrg2114 = pcmc2114) W 62, W 98 (pwrg2114 = pcmc2114) A ; GU262 (PB2/35SAcK) Event (pbs43) Linien G94-1, G94-19, G-168 Aventis USA, CAN und J (nur A ) InfoAgBiotech Cdn. DD95-05, MAFF (Japan) USDA/APHIS Appl.-No.: , OECD, Informationsmaterial Fa. Monsanto BASTA - Resistenz: p35s - AMV-Leader - pat(syn.) - RUBISCO SSU 3`, nos 3 (1 Kopie) InfoAgBiotech Cdn. DD in progress, USDA/APHIS Appl.-No.: Aventis USA BASTA - Resistenz: p35s - AMV-Leader - synth. bar - RUBISCO SSU 3` - nos 3`- uida p35s - uida - 3`nos (1 Kopie) InfoAgBiotech Cdn. DD in progress, USDA/APHIS Appl.-No.: Aventis USA BASTA - Resistenz: p35s - pat - T35S / bact. promotor - bla (partiell) (A Kopie / GU Kopien) USDA/APHIS Appl.-No.: und , AGBIOS (GMO database) DuPont USA Fettsäuren verändert: samenspez. Promotor (-αue βconglyc;soy)/ -12 Desaturase (soy)/ phaseolin 3 p35s - uida - 3`nos / bact. promotor - bla (partiell) USDA/APHIS Appl.-No.: ,AGBIOS (GMO database) Diese Übersicht erhebt keinen Anspruch auf Vollständigkeit. Für die Richtigkeit der Angaben kann keine Gewähr übernommen werden. Quellen: u. a. und und

19 Anhang 2: Qualitative PCR-Nachweise Die folgenden vorgeschlagenen PCR-Methoden zum Nachweis von GVP sind, sofern nicht anders angegeben, bereits durch amtliche Ringversuche validiert oder befinden sich in der Validierung. Mit den hier dargestellten Methoden können folgende transgene Pflanzen nachgewiesen werden: Mais: Bt176; Bt11; T14; T25; Mon810 Raps: Topas19/2; Falcon GS40/90; Liberator phoe6/ac; GT73; MS1/RF1(RF2); MS8/RF3; fettsäureveränderter Raps mit der pcamv- nptii- Genkassette Zuckerrüben: T120-7; H7-1; #77 Soja: Roundup Ready Soja (GTS ) Kartoffeln: Alle Linien mit dem nptii- Gen 1. Screeningmethoden 1.1 Mais und Soja Ein Screening nach dem 35S- CaMV-Promotor [13] erfasst 16 von 20 bisher möglichen transgenen Mais-Linien sowie alle 5 transgenen Soja-Linien: 35S-1 5 -GCT CCT ACA AAT GCC ATC A -3 35S-2 5 -GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA -3 Annealing: 54 C Produkt: 195 bp Restriktionsanalyse: Xmn I: 115 bp + 80 bp Zwei der vier verbleibenden Mais- Linien können mit einem zusätzlichen Screening nach dem Nos- Terminator erfasst werden [13]: NOS-1 5 -GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG -3 NOS-3 5 -TTA TCC TAG TTT GCG CGC TA -3 Annealing: 54 C Produkt: 180 bp Restriktionsanalyse: Nsi I: 96 bp + 84 bp 1.2 Raps Ein Screening nach dem 35S-CaMV-Promotor erweist sich bei Raps als ungünstig, da mehr als die Hälfte der transgenen Sorten nicht erfasst werden und das Cauliflower Mosaik Virus (CaMV) Raps befallen kann, wodurch die Wahrscheinlichkeit von falsch- positiven Proben erhöht wird. Um 13 von 14 möglichen transgenen Raps-Linien zu erfassen, müssen je Einzelprobe vier konstruktspezifische Nachweise durchgeführt werden (siehe unten). 1.3 Zuckerrüben Ein Screening ist hier vom Aufwand her nicht sinnvoll. Um 6 von 7 möglichen transgenen Zuckerrüben- Linien zu erfassen, müssen je Probe zwei konstruktspezifische Nachweise durchgeführt werden (siehe unten) Anhang 2, Seite 1 von 4

20 1.4 Kartoffel Die sieben dokumentierten transgenen Kartoffel- Sorten (insg. 17 Transformations-Events) können zuverlässig mit einem Screening nach dem nptii- Gen erfasst werden [13, 14]: TN GGA TCT CCT GTC ATC T -3 TN GAT CAT CCT GAT CGA C -3 Annealing: 50 C Produkt: 173 bp Restriktionsanalyse: Rsa I: 136 bp + 37 bp 1.5 Kontrolle der DNA-Amplifizierbarkeit (u. a. bei negativem Screening-Ergebnis) Für die Kontroll- PCR wird die Verwendung der Primer A1/A2 (konservierte Chloroplasten- LeutRNA, [13]) vorgeschlagen, die bei Mais ein Amplifikat von 531 bp, bei Raps ein Amplifikat von 384 bp und bei Zuckerrüben ein Amplifikat von 644 bp liefern. A1 5 CGA AAT CGG TAG ACG CTA CG 3 A2 5 GGG GAT AGA GGG ACT TGA AC 3 Annealing: 60 C Alternativ können für die Kontroll-PCR die EU- Primer (hochkonservierte 18S-rRNA) verwendet werden [15], die bei allen Pflanzen [und anderen Eukaryonten (Tiere, Hefen)] ein 136 bp- Amplifikat liefern. Dazu muss jedoch, aufgrund der hohen Kopienzahl, die Probe stark verdünnt werden (Vorschlag: 1 : 25). (Diese Methode ist noch nicht validiert.) EU TCT GCC CTA TCA ACT TTC GAT GGT A -3 EU + 5 -AAT TTG CGC GCC TGC TGC CTT CCT T -3 Annealing: 60 C 2. Spezifische Nachweise 2.1 Mais Bei positiven Screening- Proben besteht die Notwendigkeit der Differenzierung zwischen in der EU zugelassenen und nicht zugelassenen transgenen Maissorten. Spezifische Nachweise werden anhand der aktuellen, bzw. zur Veröffentlichung anstehenden LMBG Methoden (BgVV) durchgeführt (siehe unten). Bt 176 (Novartis, jetzt Syngenta), [13] CR03 5 -CTC TCG CCG TTC ATG TCC GT -3 (CDPK- Promotor) CR04 5 -GGT CAG GCT CAG GCT GAT GT -3 (cryia (b)- Gen) Annealing: 63 C Produkt: 211 bp Hybridisierungs-Sonde: DIG- ATGGACAACAACCCCAACATC Restriktionsanalyse: Taq I : bp Bt 11 (Northrup King), [13] IVS CTG GGA GGC CAA GGT ATC TAA T -3 (IVS2 intron) PAT-B 5 -GCT GCT GTA GCT GGC CTA ATC T -3 (pat- Gen) Annealing: 64 C Produkt:189 bp Hybridisierungs-Sonde: DIG- TATCTGTCTCAGGGGCAGACTC Restriktionsanalyse: Hinf I: bp Anhang 2, Seite 2 von 4

21 T14 / T 25 (AgrEvo, Aventis, jetzt Bayer) T25-F7: 5 - ATG GTG GAT GGC ATG ATG TTG -3 T25-R3: 5 - TGA GCG AAA CCC TAT AAG AAC CC -3 Annealing: 64 C Produkt: 209 bp Restriktionsanalyse: Hinf I: 121 und 88 bp Mwo I: 141 und 68 bp [13] oder: CaMV-F 5 -ATC CTT CGC AAG ACC CTT CCT C -3 (35S- Promotor) pac3-r 5 -CCC AAC CTT TGA TGC CTA TGT G -3 (pat- Gen) Annealing: 60 C Produkt: 370 bp Restriktionsanalyse: EcoRV: 140 bp bp Sal I: 60 bp bp [16] Bei Positiv- Proben erfolgt eine Unterscheidung von T14 und T25 mit Hilfe einer Integrationsort- spezifischen PCR [17]: (Diese Methode ist noch nicht validiert.) T25int2.F 5 - CGAATGTTGTTCTTCCACCACG -3 T25int2.R 5 - TCACCGTCATCACCGAAACG -3 Annealing: 60 C Produkt: 278 bp MON 810 (Monsanto), [13] VW01: 5 - TCG AAG GAC GAA GGA CTC TAA CG -3 VW03: 5 - TCC ATC TTT GGG ACC ACT GTC G -3 Annealing: 64 C Produkt: 170 bp Restriktionsanalyse: Mwo I: 109 und 61 bp Hae III: 126 und 44 bp 2.2 Raps und Zuckerrüben Der qualitative Nachweis von vier verschiedenen spezifischen Genkonstrukten in transgenem Raps erfolgt mit Hilfe von Methoden aus dem Unterausschuss "Methodenentwicklung" des LAG [16]. Bei transgenen Zuckerrüben können mit zwei dieser Nachweismethoden 6 von 7 Sorten ebenfalls erfasst werden: Topas 19/2, Falcon GS40/90, Liberator phoe6/ac (Raps, Aventis) und T120-7 (Zuckerrüben, Aventis), [16] CaMV-F 5 -ATC CTT CGC AAG ACC CTT CCT C -3 (35S- Promotor) pac3-r 5 -CCC AAC CTT TGA TGC CTA TGT G -3 (pat- Gen) Annealing: 60 C Produkt: 370 bp Restriktionsanalyse: EcoRV: 140 bp bp Sal I: 60 bp bp Mit dem npt II- Nachweis (siehe 1.4) kann eine Unterscheidung des in der EU zugelassenen Topas 19/2- Raps (Aventis) von nicht zugelassenen Aventis-Raps- Sorten im Anschluss an eine positive p35s-pat-pcr erfolgen. Eine weitere empfehlenswerte nptii- Nachweismethode verwendet folgende Primer: (Diese Methode ist noch nicht validiert.) npt-2f 5 - CTG ATG CCG CCG TGT TCC -3 npt-2r 5 - ATG TTT CGC TTG GTG GTC -3 Annealing: 53 C Produkt: 323 bp Restriktionsanalyse: PstI: 234 bp + 89 bp Anhang 2, Seite 3 von 4

22 GT73 (Raps, Monsanto) sowie H7-1 und #77 (Zuckerrüben, Monsanto bzw. Syngenta) Die Primer-Sequenzen für diesen Nachweis sind vertraulich! Anfragen sind an den UA "Methodenentwicklung" zu richten [16]. MS1/RF1+2 bzw. MS8/RF3 (Raps, PGS), [16] PGS-bar-A2 5 -GAA GTT GAC CGT GCT TGT CT -3 (SSUAra- Promotor) PGS-bar-B2 5 -CAA GTC CAC CAG GCA AGT AA -3 (bar- Gen) Annealing: 54 C Produkte: 624 bp (MS1/RF1) bzw. 454 bp (MS8/RF3) Restriktionsanalyse: Hind III: 357 bp bp (MS1/RF1) bzw. 187 bp bp (MS8/RF3) Verschiedene Rapssorten mit verändertem Fettsäuremuster [u.a. sog. Laurat- Raps (pcgn3828) und LPAAT/Trierucin- Raps (press)] (Diese Methode ist noch nicht validiert.) 35S-X NPTa 5 -ACG TTC CAA CCA CGT CTT CA -3 (p35s; CaMV) 5 -GTC CCT TCC CGC TTC AGT GAC AAC GTC -3 (nptii) bei Laurat- Raps: Annealing: 57 C Produkt: 554 bp Restriktionsanalyse: EcoRI: 264 bp bp bei Trierucin- Raps: Annealing: 57 C Produkt: ca. 450 bp Restriktionsanalyse: PstI: 100 bp bp 2.3 Soja Mit folgender Methode wird die in der EU bisher zugelassene transgene Soja- Linie GTS (Monsanto) nachgewiesen [13]: p35s-f2 5 -TGA TGT GAT ATC TCC ACT GAC G -3 (CaMV- Promotor) petu-r21 5 -TGT ATC CCT TGA GCC ATG TTG T -3 (Petunia- CTP1) Annealing: 62 C Produkt: 172 bp Hybridisierungs- Sonde: FI- 5 -GGG TCT TGC GAA GGA TAG TG -3 (Restriktionsanalyse: Bgl II: 43 bp bp) Anhang 2, Seite 4 von 4

23 Anhang 3 Prüfplan für das Subsampling Einsendeprobe (mind Samen bei Schwellenw. = 0,5%) Rückstellprobe 0 positiv -> Gehalt < 0,1% (SW 95%) Untersuchungsprobe Samen Untersuchungsprobe Samen Untersuchungsprobe Samen Schwellenwert 0,1% wird nicht mit einer SW von 95% eingehalten Identifizierug der Linie, Schwellenwert? Schwellenwert z.b. 0,5% 0 positiv -> Gehalt < 0,5 % (SW 95%) Untersuchungsprobe Samen Untersuchungsprobe Samen Untersuchungsprobe Samen Schwellenwert z.b. 0,9% Schwellenwert 0,5% wird nicht mit einer SW von 95% eingehalten 0 positiv -> Gehalt < 0,9 % (SW 95%) Untersuchungsprobe Samen Untersuchungsprobe Samen Untersuchungsprobe Samen kein Schwellenwert (nicht zugelassene Linie) Schwellenwert 0,9% wird nicht mit einer SW von 95% eingehalten Ergebnis: negativ = nicht nachgewiesen bzw. Schwellenwert unterschritten Ergebnis: positiv = nachgewiesen bzw. Schwellenwert überschritten; weitere Untersuchungen erforderlich? SW 95% = Sicherheitswahrscheinlichkeit 95% = confidence 95% Schwellenwert = der für die Linie geltende gesetzlich Schwellenwert

24 Anhang 4: Prüfplan für Quantitative PCR- Nachweise Repräsentative Saatgutprobe Screeninganalysen Erfassungsgrenze unterschritten Erfassungsgrenze überschritten Identifizierung Quantifizierung Bestimmungsgrenze unterschritten Bestimmungsgrenze überschritten