Institut für Humangenetik der Universität Ulm. Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. med. Christian Kubisch

Transkript

1 Institut für Humangenetik der Universität Ulm Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. med. Christian Kubisch Rolle der Apoptose-relevanten Gene P53AIP1 und DYRK2 für die Prädisposition zu Prostatakarzinom: Eine Assoziationsstudie unter Testung des High Resolution Meltings als alternative Genotypisierungstechnik Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm vorgelegt von Carmen Linnert aus Aalen 2011

2 Amtierender Dekan: Prof. Dr. Thomas Wirth 1. Berichterstatter: PD Dr. Christiane Maier 2. Berichterstatter: Prof. Dr. Georgia Lahr Tag der Promotion:

3 Meinen Freunden da sie sich gewünscht haben, dass ihnen auch einmal etwas gewidmet wird. Auf dass unsere Freundschaft ewig währt.

4 Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis I II 1. Einleitung Das Prostatakarzinom Ätiologie und Genetik des Prostatakarzinoms Fragestellung der Arbeit 9 2. Material und Methoden Material Methoden Ergebnisse Mutationssuche in apoptose-relevanten Genen Etablierung der HRM und Vergleich mit TaqMan -Assay Fall-Kontroll-Studie/Assoziationsstudie Diskussion Methodenvergleich HRM und TaqMan Assay Mutationssuche in Apoptosegenen und Assoziationsstudie Zusammenfassung Literaturverzeichnis 66

5 Abkürzungsverzeichnis II Abkürzungsverzeichnis A AD AQ Arg ATP C CI CTP datp dbsnp dctp ddntp dgtp DHPLC DMSO DNA dntp DRU dttp DYRK2 Nukleinbase Adenin Allelic Discrimination Allelic Quantification Arginin Adenosintriphosphat Nukleinbase Cytosin Konfidenzintervall Cytidintriphosphat Desoxyadenosintriphosphat Database Single Nucleotide Polymorphism Desoxycytidintriphosphat Didesoxynukleosidtriphosphat Desoxyguanosintriphosphat Denaturing high-performance liquid chromatography, Denaturierende Hochdruckflüssigkeitschromatografie Dimethylsulfoxid Desoxyribonucleic acid Desoxynukleosidtriphosphat digitalrektale Untersuchung Desoxythymidintriphosphat Genname, dual-specificity tyrosine-(y)- phosphorylation regulated kinase 2 ELAC2 Genname, elac homolog 2 ERG estrogen-regulated gene ESCO1 Genname, establishment of cohesion 1 homolog 1 et al. et altera (lat: und andere) ETS E-twenty-six, Familie von Transkriptionsfaktoren ETV1 und ETV4 Gene der ETS- Familie Ex fs G GTP H 2 O HET HGVS HOM HRM Exon frame-shift Nukleinbase Guanin Guanosintriphosphat Wasser heterozygot Human Genome Variation Society homozygot High-Resolution-Melting, Schmelzkurvenanalyse

6 Abkürzungsverzeichnis III HWE Hardy-Weinberg Equilibrium ICPCG International Consortium of Prostate Cancer Genetics Mb Megabasen MSR1 Genname, Macrophage scavenger receptor 1 n.b. nicht bekannt NCBI National Center of Biotechnology Information NTP Nukleosidtriphosphat OR Odds Ratio P Aminosäure Prolin p53 Genname P53AIP1 Genname, p53-regulated apoptosis-inducing protein 1 PCa PCR PIN POLI PSA R RNASEL RR rs (number) Prostatakarzinom polymerase chain reaction prostatic intraepithelial neoplasia Genname, polymerase (DNA directed) iota prostatic-specific antigen Aminosäure Arginin Genname, ribonuclease L Relatives Risiko reference single nucleotide polymorphism (number) RT-PCR Real-time polymerase chain reaction S Aminosäure Serin Ser Serin SNP single nucleotide polymorphism T Nukleinbase Thymin TBE TRIS-Borat-EDTA-Puffer TMPRSS2 Genname, Transmembranprotease Serin 2 TMPRSS2-ERG Fusion des Transmembranprotease Serin 2-Gens mit dem Estrogen-regulated-Gen TNM TRUS TTP UTR V wt Tumor, Nodes, Metastasis transrektaler Ultraschall Thymidintriphosphat untranslated region Aminosäure Valin Wildtyp

7 Einleitung 1 1. Einleitung 1.1 Das Prostatakarzinom Das Prostatakarzinom (PCa) bezeichnet bösartige Tumoren der Vorsteherdrüse beim Mann. Die Prostata liegt im kleinen Becken des Mannes zwischen Harnblase und Rektum und umgibt die Harnröhre. Sie ist für die Bildung der Samenflüssigkeit zuständig Epidemiologie Das Prostatakarzinom ist mit 26% der häufigste Tumor des Mannes in Deutschland. [34] Auf der Liste der Todesursachen durch Krebserkrankungen beim Mann steht das Prostatakarzinom an dritter Stelle nach den bösartigen Neubildungen der Verdauungsorgane und des Lungenkrebs.[41] Das mittlere Erkrankungsalter liegt bei 69 Jahren, die Inzidenz steigt mit dem Alter stark an. Die Sterberaten sind jedoch rückläufig, die 5-Jahres-Überlebensrate liegt zwischen 83 und 94%.[34] Die Inzidenz liegt bei Neuerkrankungen/Jahr und hat in den letzten Jahrzehnten stark zugenommen, was auch ein Resultat der verbesserten Diagnostik und Früherkennungsmaßnahmen war.[17] Bei Autopsien wird eine viel höhere Prävalenz des PCa (Prostatakarzinom) festgestellt, was darauf schließen lässt, dass ein Großteil der Prostatakarzinome zu Lebzeiten nie klinisch relevant wird Klinik Ein Tumor der Prostata wird erst sehr spät klinisch auffällig. Typische Symptome sind dann Harnverhalt, wie er auch bei der benignen Prostatahyperplasie auftritt, und Makrohämaturie (Blut im Urin). Aufgrund des latenten Erscheinens des PCa wird viel Wert auf die jährlichen Vorsorgeuntersuchungen gelegt.

8 Einleitung Diagnostik und Screening Bei der digital rektalen Untersuchung (DRU) wird die Prostata vom Rektum des Mannes aus mit den Fingern ertastet. Auch mithilfe der transrektalen Ultraschalluntersuchung (TRUS) wird die Prostata nach hyporeflexiven Gebieten (z.b. Knoten) abgesucht. Zur Diagnostik gehört neben der DRU und der TRUS auch die Messung des PSA-Wertes. Das Prostatic-specific antigen (PSA) ist ein von der Prostata gebildetes Enzym, welches zur Verflüssigung der Samenflüssigkeit dient. Verändertes Prostatagewebe gibt mehr PSA ab, das dann im Blut gemessen werden kann. Im Rahmen der jährlichen Prostatakrebsvorsorge wird bei Männern über 45 Jahren vom Urologen der PSA-Wert im Blut bestimmt. Bei einem PSA-Wert über 4ng/ml oder einem auffälligen Tastbefund bei der DRU wird eine weitere Diagnostik angegangen. Diese beinhaltet meist eine Nadelbiopsie der Prostata. Der PSA-Wert ist als Früherkennungsmethode besser geeignet als die digital rektale Untersuchung. Allerdings kann der PSA-Wert auch in Abwesenheit eines Tumors erhöht sein, zum Beispiel nach Geschlechtsverkehr, Radfahren bei Entzündung oder Obstipation und liefert somit falsch-positive Werte. Seit Einführung des PSA-Screenings in manchen Ländern stieg die Inzidenz des PCa stark an.[17] Hierbei stellt sich die Frage, ob durch dieses Screening Prostatatumoren bei Männern diagnostiziert werden, die bis zu ihrem Tod des Mannes latent und somit ohne klinische Beschwerden gewesen wären. Die Biopsie ist die einzige Methode für eine sichere Diagnose eines PCa. Am entnommenen Prostatagewebe bestimmt der Pathologe den sogenannten Gleason-Score, welcher durch eine Beschreibung des histologischen Bildes der Gewebeprobe den Malignitätsgrad der Gewebeprobe festlegt. Mittels der TNM-Klassifikation der Internationalen Gesellschaft gegen Krebs wird der Ausbreitungsgrad des Tumors beschrieben. Sowohl die TNM-Klassifikation als auch der Gleason-Score trägt zur Risikoabschätzung und Therapieentscheidung bei Therapie Über die Art der Therapie wird aufgrund der Ausbreitung und des Malignitätsgrad des Tumors, aber auch anhand des Alters und des Gesundheitszustands des Patienten entschieden. Da man nur sehr schwer zwischen einem aggressiven und nicht aggressiven

9 Einleitung 3 Prostatakarzinom unterscheiden kann, stellt die Wahl der Therapie oft eine schwierige Entscheidung dar. Bei einem auf die Prostata beschränkten Karzinom kann ein kurativer Ansatz erfolgen. Dieser beinhaltet entweder die Totalentfernung der Vorsteherdrüse oder deren Bestrahlung. Bestrahlt werden kann extern oder mittels sogenannter Seeds bei der Brachytherapie. Bei der Brachytherapie wird eine hohe Dosis Strahlung im betroffenen Gewebe unter Schonung des umgebenden Gewebes erreicht. Ein fortgeschrittenes Prostatakarzinom kann entweder nur mit Bestrahlung oder mit Operation plus adjuvanter Bestrahlung behandelt werden. Eine weitere Möglichkeit nach Diagnose eines PCa ist die sogenannte Watchful Waiting oder Active Surveillance Methode. Da bekannt ist, dass ein hoher Anteil der bei Autopsien festgestellten PCas lebenslang klinisch latent verlaufen, kann vor allem bei älteren Patienten mit gut bis mäßig differenziertem PCa ohne klinische Beschwerden diese Strategie der Aktiven Überwachung angewandt werden. Es erfolgt in regelmäßigen Abständen eine PSA-Kontrolle sowie eine Stanzbiopsie, um ein eventuelles Fortschreiten der Erkrankung rechtzeitig zu erkennen. Außerdem gibt es noch die Systemische Therapie, bei der das stark androgen-abhängig wachsende PCa durch Hormonentzugstherapie behandelt wird. Die Systemische Therapie erfolgt als Standardverfahren in palliativen Situationen bei metastasiertem PCa. Eine Chemotherapie kommt beim PCa erst dann infrage, falls die Möglichkeiten der Hormon- und Strahlentherapie ausgeschöpft wurden. 1.2 Ätiologie und Genetik des Prostatakarzinoms Bei Krebserkrankungen können verschiedene Faktoren wie Umwelt, Ernährungsgewohnheiten, Alter oder familiäre Anamnese in der Ätiologie beteiligt sein. Beim Prostatakarzinom sind bisher nur die Faktoren Alter, ethnische Herkunft und positive Familienanamnese wissenschaftlich belegt.[5;7] Mögliche Ursachen für ein erhöhtes Vorkommen einer Krankheit in einer Familie können sowohl genetische als auch umweltbedingte Faktoren sein. Zwillingsstudien können feststellen, ob und in welchem Ausmaß eine genetische Komponente bei einer Krankheit ursächlich ist. Lichtenstein et al. untersuchen in ihrer Studie die Auswirkungen von genetischen und umweltbedingten Faktoren bei der Entstehung von verschiedenen Krebserkrankungen an Tausenden von Zwillingspaaren. Meist macht die Heritabilität nur einen kleinen Anteil der Ätiologie von Krebserkrankungen aus. Beim PCa und beim

10 Einleitung 4 Kolorektalen Karzinom zeigte sich allerdings ein signifikant erhöhter Effekt von vererbbaren Faktoren. 42% des Risikos für PCa könnte auf genetische Ursachen zurückzuführen sein. Familienanalysen können zwar nicht zwischen den Ursachen für ein erhöhtes Risiko differenzieren, sie können aber das Risiko für Verwandte von Prostatakarzinompatienten einschätzen fasst eine Meta-Analyse von Johns und Houlston 13 dieser Studien zusammen. Das Relative Risiko (RR) der Verwandten ersten Grades von Betroffenen ist durchschnittlich 2,5mal so hoch wie das der Verwandten von Nichtbetroffenen. Dieses Risiko ist am höchsten bei Verwandten von Fällen mit einem Diagnosealter jünger als 60 Jahre und sinkt mit zunehmendem Alter. Das RR erhöht sich bei mehreren Betroffenen in einer Familie auf 3,5. Außerdem zeigen die Studien, dass Söhne von betroffenen Vätern ein geringeres Risiko als die Brüder der Betroffenen haben.[20] Mit der Zwillingsstudie von Lichtenstein et al. wurde eine generelle Heritabilität des PCa gezeigt. Um nun herauszufinden, welchem Vererbungsmuster diese Heritabilität folgt, wendet man Segregationsanalysen an. Dabei wird der beobachtete Anteil von Betroffenen in einem Kollektiv mit dem nach einem bestimmten genetischen Modell (z.b. Mendelscher Erbgang) zu erwartendem Anteil verglichen. In einigen Segregationsanalysen wird gezeigt, dass ein autosomal-dominantes Modell am besten das Vererbungsmuster des PCa erklärt. Ein seltenes Allel mit hoher Penetranz soll für 43% der PCa in jüngeren Patienten verantwortlich sein. Dieser Anteil macht aber nur einen kleinen Teil der PCa-Fälle aller Altersgruppen (z.b. 9% in der Gruppe der 85jährigen) aus. [7;14] Schaid et al. finden im Gegensatz zu den anderen Segregationsanalysen kein einheitliches Vererbungsmuster, auch wenn auch bei ihnen das autosomal-dominante Modell am besten zu derjenigen Gruppe passt, bei denen das Diagnosealter unter 60 Jahren liegt. Aufgrund ihrer Daten gehen sie aber von einer genetischen Heterogenität des Prostatakarzinoms aus.[36] Auch weitere Segregationsanalysen finden sowohl ein autosomal-dominantes für jüngeres Diagnosealter, wie auch ein rezessives und X-chromosomales Vererbungsmuster für spätes Diagnosealter. [9]. Gong et al. adjustieren diese drei Vererbungen in ihrer Analyse auf Kalenderjahr, Alter und Rasse, um Einflüsse der verbesserten und schnelleren Diagnostik auf die Inzidenz des Prostatakarzinoms zu umgehen. Sie beschreiben, dass ein multifaktorielles Modell am besten zur Heritabilität des PCa passt. Für die meisten vererbten PCas sollen viele Varianten in Genen mit niedriger Penetranz ursächlich sein. Für das zahlreiche und frühe Auftreten des PCas in jüngeren Männern in einigen Familien

11 Einleitung 5 sollen dagegen nur wenige seltene Mutationen mit hoher Penetranz verantwortlich sein. [13] Ausgehend von diesem multifaktoriellen Konzept muss nun nach Varianten und Mutationen in Genen gesucht werden, die bei der Entstehung von PCa eine Rolle spielen. Dabei geht man davon aus, dass der Locus, auf dem die verantwortliche Variante oder Mutation liegt, immer zusammen mit dem Phänotyp Prostatakarzinom vererbt wird. Durch Kopplungsanalysen kann diese Verbindung in Familien gefunden werden. Bei monogenen Erkrankungen ist es so mithilfe von Mikrosatelliten-Markern möglich das mutierte Gen zu identifizieren. Sind jedoch mehrere sogenannte Common variants, verschiedene Varianten mit niedriger Penetranz aber kumulativ wirkendem Risiko, bei der Entstehung einer Krankheit beteiligt, erhält man durch solche Familienanalysen viele verschiedene Genorte, die mit dem Phänotyp gekoppelt sind. Im Falle einer solchen komplexen Erkrankung kann in Assoziationsstudien gezeigt werden, ob eine Variante häufiger in der Gruppe der Betroffenen auftritt als in den Kontrollgruppen. Für Common variants ist es notwendig, dafür eine möglichst große Fallzahl zu untersuchen. Für das Prostatakarzinom wurden mehrere genomweite Kopplungsanalysen gemacht. In unserer deutschen Familiensammlung ergab sich eine große Heterogenität der infrage kommenden Loci.[25] Auch andere Arbeitsgruppen der ICPCG fanden in ihren Familiensammlungen eine starke Verteilung von möglichen Loci, die gekoppelt mit dem Phänotyp Prostatakarzinom vererbt werden. Allerdings wurden dabei auch die ersten drei Prostatakarzinomgene RNASEL, ELAC2 und MSR1 identifiziert [6;39;43;50;51], die sich aber in weiteren Studien an unserer deutschen Population als weniger bedeutende Gene herausgestellt haben.[26;27;46] Heterogenität des PCa und Lösungsstrategien Bei großer Heterogenität einer Erkrankung ist es notwendig, die Ergebnisse der Kopplungsanalysen auf größere Familiensammlungen auszuweiten. Dazu schlossen sich Prostatakarzinom-Arbeitsgruppen zum International Consortium for Prostate Cancer Genetics (ICPCG) zusammen und konnten somit an über 1200 Familien weitere Kopplungsanalysen durchführen. Sie fanden fünf Kandidatenloci. [49] Eine weitere Möglichkeit, die Heterogenität einzugrenzen, stellt die Bildung von Subgruppen innerhalb einer großen Sammlung an Familien dar. Dabei wird versucht, die

12 Einleitung 6 kleinere Gruppe auf ein bestimmtes Merkmal zu stratifizieren, um dann für diese Untergruppe relevante Gene in der Entstehung der Krankheit zu finden. Das können beim Prostatakarzinom epidemiologische (Region, Alter), klinische (Gleason-Score) oder molekulargenetische Merkmale sein. Ein molekulargenetischer Parameter stellt die in Prostatakarzinomfamilien häufig vorkommende TMPRSS2-ERG Genfusion dar Die TMPRSS2-ERG Genfusion Epitheliale Tumoren waren bis zur Entdeckung der TMPRSS2-ERG Fusion nur durch unspezifische chromosomale Abberrationen gekennzeichnet. In anderen Karzinomen, wie zum Beispiel beim Ewing-Sarkom, bei Lyphomen oder Leukämien waren Fusionen zwischen zwei ähnlichen Genen bereits bekannt.[35] Beim Prostatakarzinom fanden Tomlins et al ein Fusionstranskript zwischen TMPRSS2 und ERG, ETV1 oder ETV4. In 79,3% der Prostatakarzinome wurde die Genfusion entdeckt, sowie in über 90% der Fälle, bei denen eine Überexprimierung von ERG oder ETV1 vorhanden war. Die Daten von Tomlins et al. wurden durch mehrere andere Autoren bestätigt. ERG ist der Hauptpartner bei einer Fusion mit TMPRSS2, Zusammenschlüsse mit ETV1 und einem weiteren Mitglied der ETS-Familie, ETV4, stellen seltene Ereignisse dar. [33;40;45;52] Zusammen mit der Inzidenz des PCas betrachtet, stellt die TMPRSS2-ERG Fusion die bis heute häufigste Fusion im menschlichen Genom dar.[43] TMPRSS2 (Transmembranprotease Serin 2) gehört zur Familie der membranverankerten Serinproteasen. Das Gen liegt auf Chromosom 21 und wird im Vergleich zu anderen Organen in normalem und neoplastischem Prostatakarzinomgewebe stark exprimiert. ERG wird in der Fusion mit TMPRSS2 androgenabhängig überexprimiert, da der Promoter von TMPRSS2 sensibel auf die männlichen Geschlechtshormone reagiert. ERG gehört zu den ETS-Proteinen (E-twenty-six-transforming-specific). Sie sind Transkriptionsfaktoren, die bei Zellproliferation und differenzierung, Entwicklung und Apoptose beteiligt sind. [3;37] Zusammen mit anderen ETS-Mitgliedern gehört ERG zu den bekannten Onkogenen, welche bei Translokationen im Ewing-Sarkom und der akuten myeloischen Leukämie beteiligt sind. [32]

13 Einleitung 7 Die Ursache der TMPRSS2-ERG Fusion ist eine Deletion von circa drei Mb zwischen den beiden Genen auf ihrem Lokus auf Chromosom 21. Die Deletion tritt in circa 60% der Fälle auf, eine seltenere Ursache stellt der komplexere Mechanismus einer chromosomalen Translokation dar. Die Deletion tritt immer im gleichen Gebiet auf, doch dort mit großer Variabilität. Sie kann hetero- und homozygot auftreten. Sie trägt damit zur klinischen und molekulargenetischen Heterogenität des PCas bei. [18;22;33;52] In mehreren Studien wurde eine Assoziation zwischen der Klinik des Prostatakarzinoms und der Expression des Fusiontranskripts untersucht. Perner et al. fanden einen statistisch signifikanten Zusammenhang zwischen TMPRSS2-ERG Fusion und höheren Tumorstadien sowie Metastasierung. [33] Die TMPRSS2-ERG Fusion wurde nur in Krebszellen und nicht in PIN (prostatic intraepithelial neoplasia) gefunden, was die Annahme erlaubt, dass es sich bei der Fusion um den Auslöser zur Entstehung von invasivem PCA aus PIN Läsionen handelt.[44] Demichelis et al. zeigten einen signifikanten Zusammenhang zwischen TMPRSS2-ERG fusionspostivem Status und Tod durch Prostatakarzinom. Fusionspositive Tumoren scheinen einen aggressiveren Phänotyp zu haben.[10] Hofer et al. untersuchten 2009 fusionspositive Probanden aus Ulmer Familien mit mehreren Betroffenen, da eine Analyse der Fusion sich in den bisherigen Studien auf sporadische Fälle beschränkte. In ihrer Kopplungsanalyse wurden mehrere Loci auf Chromosom 9, 18 und dem X- Chromosom gefunden. Auf diesen Regionen werden Gene der DNA-Reparatur vermutet, die in die Entstehung der TMPRSS2-ERG Fusion involviert sind.[19] Wie schon unter Punkt erwähnt, stellt diese Genfusion einen molekularen Marker dar, mit dem Subgruppen definiert werden können Kandidatengene des TMPRSS2-ERG positiven Prostatakarzinoms Ein Teil der Familiensammlung des ICPCG wurde auf TMPRSS2-ERG Fusion getestet. Dabei ergab sich eine hohe Inzidenz von 59% im familiären PCa. Es lässt sich die Hypothese formulieren, dass ein Chromosomenschaden, wie die TMPRSS2-ERG Fusion, entweder daraus resultiert, dass die Reparaturmechanismen nicht funktionieren oder dass die geschädigten Zellen nicht mehr dem programmierten Zelltod unterliegen. Auf Basis dieser Annahme ist der nächste Schritt die Suche nach Kandidatengene aus dem Bereich der DNA-Reparatur oder Apoptoseinduktion, die eine Prädisposition für eine TMPRSS2-

14 Einleitung 8 ERG Fusion darstellen. An zehn der TMPRSS2-ERG positiven Stammbäume wurde erneut eine Kopplungsanalyse angewendet, welche mehrere Kandidatenloci für eine mögliche Prädisposition zur Genfusion aufdeckte. In diesen Regionen liegen zehn Gene der DNA- Reparatur beziehungsweise der Apoptoseinduktion. Sie sind in Tabelle 1 aufgelistet. Diese Kandidatengene werden nach Mutationen oder Polymorphismen durchsucht, wobei sich die vorliegende Arbeit auf die Gene der Apoptoseinduktion P53AIP1 und DYRK2 konzentriert. Die beiden Gene liegen auf einer Linie des Apoptoseweges. DYRK2 wird nach DNA-Schädigung aktiviert und phosphoryliert das Tumorsuppressorgen P53. Bei großem Schaden an der DNA reguliert P53 die Expression des Proteins p53aip1 hoch, welches durch Störung der Membranstabilität der Mitochondrien die geschädigte Zelle in Apoptose führt. Tabelle 1: Kandidatenloci und Gene der DNA-Reparatur und Apoptoseinduktion in Kopplungsregionen der TMPRSS2- ERG positiven Familien Locus Gen Funktion des Gens 5q14 XRCC4 DNA-Reparatur 9p13 APTX DNA-Reparatur 9p13 XRCC9/FANCG DNA-Reparatur 9q21 SMC5 DNA-Reparatur 9q21 RMI1 DNA-Reparatur 10q26 BCCIP DNA-Reparatur 11q24 P53AIP1 Apoptoseinduktion 12q15 DYRK2 Apoptoseinduktion 13q12 BRCA2/FANCD1 DNA-Reparatur 18q21 POLI DNA-Reparatur Legende: XRCC4 = X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 4; APTX = Aprataxin; XRCC9/FANCG = X- ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 9/Fanconi anemia complementation group G; SMC5 = structural maintenance of chromosomes 5; RMI1 = RecQ mediated genome instability 1; BCCIP = BRCA2 and CDKN1A interacting protein; p53aip1 = p53-regulated apoptosis-inducing protein 1; DYRK2 = dual-specificity tyrosine-(y)-phosphorylation regulated kinase 2; BRCA2/FANCD1 = breast cancer 2/Fanconi anemia, complementation group D1; POLI = polymerase iota

15 Einleitung Fragestellung der Arbeit Das Prostatakarzinom gehört zu den häufigsten malignen Erkrankungen des Mannes. Aufgrund seiner genetischen Heterogenität ist es sinnvoll, in Studien zur Genetik des PCa einzelne Subgruppen zu definieren und zu untersuchen. Die TMPRSS2-ERG Fusion stellt ein häufiges Ereignis in der Entstehung des Prostatakarzinoms dar und kann als genetisches Merkmal zum Definieren einer Subgruppe herangezogen werden. Aus einem großen Kollektiv wurden für diese Arbeit zehn TMPRSS2-ERG positive Familien in einer Kopplungsanalyse untersucht. Unsere Hypothese ist, dass es eine Prädisposition für die TMPRSS2-ERG Fusion durch Varianten und Mutationen in Genen der Apoptoseinduktion gibt. In dieser Arbeit werden im ersten Teil die Apoptosegene P53AIP1 und DYRK2 im Genom von zwölf TMPRSS2-ERG positiven Probanden sequenziert und nach neuen und bereits bekannten Varianten und Mutationen gesucht. Im zweiten Teil der Arbeit wird eine Auswahl aus den gefundenen Varianten erstellt, nach denen dann im Fall-Kontrollkollektiv gesucht wird. Um eine Assoziation zwischen Variante und Prostatakarzinomentstehung zu überprüfen, werden die Häufigkeiten der Varianten im Fallkollektiv mit den Kontrollen verglichen. Im zweiten Teil der Arbeit wird außerdem ein Methodenvergleich bei der Genotypisierung der Probanden unternommen. Die neue Methode der Genotypisierung mittels Schmelzkurvenanalyse (HRM ) wird mit dem bereits etablierten Verfahren der Genotypisierung mittels TaqMan Assay verglichen. Die HRM wird in dieser Arbeit für die Genotypisierung von Einzelbasenaustausch, Haplotypen und frame-shift- Mutationen in P53AIP1 und DYRK2 getestet. Abbildung 1 gibt noch einmal einen Überblick über Fragestellung und Kontext der vorliegenden Arbeit.

16 Einleitung 10 Prostatakarzinom große Heterogenität in Kopplungsanalysen Subgruppenbildung: TMPRSS2-ERG als häufiges Ereignis in PCa 12 TMPRSS2-ERG fusionspositive Probanden Gedanke: Suche nach Varianten/Mutationen, die eine Prädisposition für eine TMPRSS2-ERG Fusion darstellen könnten, in Kandidatengenen Gene der DNA- Reparatur -> Andere Arbeiten Gene der Apoptoseinduktion p53aip1 Varianten DYRK2 Assoziationsstudie mit >1000 Probanden HRM Methodenvergleich TaqMan Abbildung 1: Überblick über Fragestellung und Kontext der vorliegenden Arbeit Legende: TMPRSS2-ERG = Fusion des Transmembranprotease Serin 2-Gens mit dem Estrogen-regulated-Gen; PCa = Prostatakarzinom; p53aip1 = p53-regulated apoptosis-inducing protein 1; DYRK2 = dual-specificity tyrosine-(y)- phosphorylation regulated kinase 2; HRM = High-Resolution-Melting

17 Material und Methoden Material und Methoden 2.1 Material Probanden Die Urologische Abteilung der Uniklinik Ulm sammelte ab 1994 bundesweit familiäre Prostatakarzinomfälle. Dazu kontaktierten sie urologische Kliniken, Rehabilitationskrankenhäuser und niedergelassene Urologen, welche das Einverständnis der Indexpersonen einholten und Fragebögen zur Familienanamnese ausfüllten. Anhand dieser Angaben wurden weitere Familienangehörige kontaktiert und um Blutproben gebeten. Für Assoziationsstudien wurden ab 1998 die DNA von sporadischen Prostatakarzinomfällen und Kontrollen gesammelt. Die sporadischen Fälle wurden größtenteils von der Urologie Ulm gestellt. Die Probanden wurden dort meist einer radikalen Prostatektomie unterzogen. Das mittlere Erkrankungsalter und die klinische Ausprägung unterscheidet sich im Durchschitt nicht von den familiären Fällen. Die Kontrollen sind ältere Männer, die von verschiedenen Abteilungen der Universitätsklinik Ulm gesammelt wurden. Bei ihnen bestand weder ein Hinweis auf ein Prostatakarzinom noch hatten sie eine positive Familienanamnese. Bei einem Großteil der Kontrollen wurde eine digital rektale Untersuchung oder ein PSA-Test gemacht, um den gesunden Status zu bestätigen. Für die Analyse der Kandidatengene P53AIP1 und DYRK2 wurde zwölf fusionspositiven Probanden sequenziert. Für die Variantensuche im großen Kollektiv und die folgende Assoziationsstudie konnten 2228 Probanden herangezogen werden; 867 familiäre Prostatakarzinompatienten und deren Familienangehörige, 328 Fälle mit sporadischem Prostatakrebs sowie 1033 Kontrollen.

18 Material und Methoden Enzyme und Primer Enzyme AmpliTaq Gold PCR MasterMix Applied Biosystems, Warrington, UK (2x, 250U) Exonuklease 1 Stammlösung (10U/µl) KAPA2G Robust Polymerase (5U/µl) usb, Cleveland,USA peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) 1un/µl (Tested UserFriendly ) usb, Cleveland, USA Taq-Polymerase illustra 5000U/ml (250U) GE Healthcare, Buckinghamshire,UK Oligonukleotide PCR- und Sequenzierprimer und die nicht markierten Sonden für das High Resolution Melting wurden alle bei biomers.net GmbH, Ulm eingekauft. PCR-Primer Tabelle 2: PCR-Primer p53aip1 = p53-regulated apoptosis-inducing protein 1; DYRK2 = dual-specificity tyrosine-(y)-phosphorylation regulated kinase Genname/Exon Primername Primersequenz P53AIP1/Exon 1 P53AIP1/Exon 2ABC/3AB P53AIP1/Exon 4AB DYRK2/Exon 1 und 2 DYRK2/Exon 3a DYRK2/Exon 3a1 DYRK2/Exon 3b P53AIP1_ex1h P53AIP1_ex1r P53AIP1_ex2ABCh P53AIP1_3r P53AIP1_ex4Ah P53AIP1_ex4Br DYRK2_ex1h DYRK2_ ex 2r DYRK2_ex3h DYRK2_ ex3_s3r DYRK2_ex3h DYRK2_ ex3sx DYRK2_ex3_s4h DYRK2_ex3r_n1 5'-tct gct gca cac atg gaa ac-3' 5'-cga gat gcg tgt gaa acc-3' 5'-gag ttt ccc aaa gca tct cc-3' 5'-tca gat ggc aaa ttt cag ga-3' 5'-aga tag aat aat gat gtg cct tac-3' 5'-aat gtg ggc gat tga ggt-3' 5'-tgt agc aga cgc gag gc-3' 5'-ggg ctg ctt gta tct cga c-3' 5'-tct gtt agg cat ggc att-3' 5'-gcc atc tga gag agt cgt ga-3' 5'-tct gtt agg cat ggc att-3' 5'-act ttg tga tcg tag gcc t-3' 5'-ggg ctc cag aag tga tcc-3' 5'-aac tta aag cat tgt cct cat gt-3' Produktlänge 479 bp 1669 bp 1027 bp 1070 bp 1402 bp 704 bp 834 bp

19 Material und Methoden 13 Sequenzierprimer Tabelle 3: Sequenzierprimer p53aip1 = p53-regulated apoptosis-inducing protein 1; DYRK2 = dual-specificity tyrosine-(y)-phosphorylation regulated kinase Genname Exon P53AIP1 Exon 1 P53AIP1 Exon 2ABC/3AB P53AIP1 Exon 4AB DYRK2 Exon 1 und 2 DYRK2 Exon 3a DYRK2 Exon 3a1 DYRK2 Exon 3b Primername P53AIP1_ex1r P53AIP1_2ABCh P53AIP1_ex2ABCr P53AIP1_ex3h P53AIP1_ex4Ah P53AIP1_ex4Br DYRK2_ex1h DYRK2_ex1r DYRK2_ex2h DYRK2_ex2r DYRK2_ex3_s1h DYRK2_ex3_s2h DYRK2_ex3_s3r DYRK2_ ex3sx DYRK2_ex3_s4h DYRK2_ex3r_n1 Primersequenz 5'-cga gat gcg tgt gaa acc-3' 5'-gag ttt ccc aaa gca tct cc-3' 5'-agc tct cac ttt ctg gat gc-3' 5' aga tag aat aat gat gtg cct tac-3' 5'-aat gtg ggc gat tga ggt-3' 5'-tgt agc aga cgc gag gc-3' 5'-gag gtg ggt ttg gac agc-3' 5'-agc tgt cca aac cca cct c-3' 5'-gct cac gac aca acc aaa t-3' 5'-gac cag gga tca tat gtg ca-3' 5'-gcc atc tga gag agt cgt ga-3' 5'-act ttg tga tcg tag gcc t-3' 5'-ggg ctc cag aag tga tcc-3' 5'-aac tta aag cat tgt cct cat gt-3' HRM Primer Tabelle 4: HRM Primer p53aip1 = p53-regulated apoptosis-inducing protein 1; DYRK2 = dual-specificity tyrosine-(y)-phosphorylation regulated kinase; HRM = High-Resolution-Melting Gen Variante Primername Primersequenz Produktlänge P53AIP1/ c.63_64insg f_n4_p53aip1_r21fss32x r_n1_p53aip1_r21fs 5'-ttc aga tct gct caa gct tcc t-3' 5'-ggt tct ggt ctc ccc tgc-3' 67 bp P53AIP1/ c.304a>g c.313c>t f_n1_p53aip1_v4_5 r_n2_p53aip1_v4_5 5'-taa att ctc tcc ctc cct act ga-3' 5'-gat cat agc tga gct caa atg c-3' 116 bp DYRK2/ c.1491g>t f_n1_dyrk2 r_n2_dyrk2 5'-gat ggc tct gtg gtc cta aac-3' 5'-caa gga aaa ggg gat cat ca-3' 114 bp

20 Material und Methoden 14 HRM Sonden Tabelle 5: HRM Sonden p53aip1 = p53-regulated apoptosis-inducing protein 1; DYRK2 = dual-specificity tyrosine-(y)-phosphorylation regulated kinase; HRM = High-Resolution-Melting Gen Variante P53AIP1 c.304a>g c.313c>t DYRK2 c.1491g>t Sondenname Sondensequenz Schmelztemperatur p_n2_p53aip1_v4_5 p_n2_dyrk2 5'-cca gtg gcc tgt ctc taa gca ct-3' 5'-tca gcg cgt tac ccc act ct-3' 56 C 57 C TaqMan -Sonden Sonden für die Genotypisierung mit dem TaqMan -Assay wurden selbst definiert oder bereits vordefinierte Sonden bei Applied Biosystems, Foster City, USA bestellt. Tabelle 6: Selbstdefinierte und gekaufte TaqMan -Sonden p53aip1 = p53-regulated apoptosis-inducing protein 1; DYRK2 = dual-specificity tyrosine-(y)-phosphorylation regulated kinase; VIC /FAM = Farbstoffe Gen Variante P53AIP1 c.304a>g P53AIP1 c.95c>a P53AIP1 c.20c>t DYRK2 c.1491g>t Selbst definierte Sonden Sequenz Hin/ Rück TCTCCAGGCCTTTCCTTCCT/ TGATCATAGCTGAGCTCAAATGCT GGACTGGCCCTAACAACAAAT/ TGTCTGAGCCCTGCCATTC Gekaufte Sonden Assay-ID: C _20 Assay-ID: C _10 Sonde VIC / Sonde FAM ACAGTGCTTAGAGACAG/ CAGTGCTTGGAGACAG ACCTCTCGGTGATGC/ ACCTCTAGGTGATGCC Plasmide Die zur Verifizierung der Variante R21fs eingesetzten Plasmide wurden freundlicherweise von Antje Rinckleb bereitgestellt Chemikalien Agarose Dimethylsulfoxid (DMSO) Roth, Karlsruhe Serva, Heidelberg

21 Material und Methoden 15 dntp s Ethanol absolut Ethidiumbromid EvaGreen (20x conc.in water) H 2 O Chromanorm Hi-Di Formamide Magnesiumchlorid 25mM Natriumacetat 3M (ph 5,2) Natriumchlorid GE Healthcare, Buckinghamshire, UK VWR Prolabo, Darmstadt Böringer, Mannheim Biotrend, Köln VWR Prolabo, Darmstadt Applied Biosystems, Warrington, UK GE Healthcare, Buckinghamshire, UK Merck, Darmstadt VWR Prolabo, Darmstadt Puffer, Lösungen, Längenstandards Agarosegele Gene Ruler DNA Ladder Ultra Low Range Ladepuffer für Agarosegele PCR-Puffer (10x) (1,5mM) Phage PhiX DNA/ Hae-III Markers (1µg/µl) Sequenzierpuffer (5x) TBE-Puffer (10x) 0,8-1,5% Agarose in TBE Fermentas, Burlington, Canada 1,7 ml Glycerin 0,25 ml Bromphenolblau 0,25 ml Xylencyanol 2,8 ml Aqua bidest. GE Healthcare, Buckinghamshire, UK Promega, Madison, USA Applied Biosystems, Warrington, UK 0,9 M Tris 0,89 M Borsäure 20mM EDTA(pH 8,0) ad 1 l H 2 O bidest Kits BigDye Terminator v3.1cycle Sequencing Kit KAPA2G Robust PCR Kit Applied Biosystems, Foster City, USA PEQLAB Biotechnologie GmbH

22 Material und Methoden 16 REPLI-g UltraFast Mini Kit (25) TaqMan Genotyping Master Mix QIAGEN, Hilden Applied Biosystems, Foster City, USA Laborgeräte ABI Prism 3100 Genetik Analyser Geldokumentation Pipettierroboter Multi Probe II Vortex Genie 2 Waage Sartorius 7900HT Fast Real-Time PCR System Zentrifugen Biofuge pico Labofuge 400 Spectrafuge Mini Elektrophorese Power Pac 300 Thermocycler Biometra T Gradient Gene Amp PCR System 9600 Applied Biosystems, Foster City, USA Vilber Lourmat Deutschland GmbH, Reutlingen PerkinElmer, Rodgau-Jügesheim Bender& Habein AG, Zürich, Schweiz Sartosius-Werke GmbH, Göttingen Applied Biosystems, Foster City, USA Heraeus, Hanau Heraeus, Hanau Labnet International Inc., Woodbridge, NJ, USA BIO-RAD, München Biomedizin Analytik Göttingen PerkinElmer Inc., Wellesley, USA Hilfsmittel Adhesive PCR Foils Seals Biosphere Filter Tips (10µl, 20µl, 100µl, 200µl, 1000µl) Eppendorf Tubes (1,5ml) peqlab Biotechnologie, Erlangen Sarstedt, Nümbrecht Eppendorf, Hamburg Matrix equalizer 8-Kanalpipette (30µl) Matrix Impact (30µl) Thermo Scientific Inc., Bonn Thermo Scientific Inc., Bonn

23 Material und Methoden 17 MicroAmp 8-Tube-Strip (0,2ml) Applied Biosystems, Darmstadt MicroAmp 8-Cap Strip Applied Biosystems, Darmstadt MicroAmp Optical Adhesive Film Applied Biosystems, Darmstadt RoboRack Clear Non-conductive Tips PerkinElmer, Inc., Wellesley, USA (20µl, 200µl) 96 Well PCR Plate peqlab, Erlangen 384-Well Clear Optical Reaction Plate Applied Biosystems, Foster City, USA Software ABI PRISM 3100 Genetic Analyser Data Collection Software v1.1 BLAST HRM v2.0 Microsoft Excel 2003 Microsoft Word 2003 NCBI SNP Suchmaschine Primer3Plus Amplicon Design Applied Biosystems, Foster City, USA Applied Biosystems, Foster City, USA Microsoft, Redmond, WA, USA Microsoft, Redmond, WA, USA SeqScape v2.5 Sequencing Analysis 3.7 ABI Prism Applied Biosystems, Foster City, USA Applied Biosystems, Foster City, USA SDS 2.3 StatView for Windows Version SAS Institute Inc., Cary, NC, USA

24 Material und Methoden Methoden PCR (Polymerase Chain Reaction) Kary Mullis erfand 1983 das Prinzip der Polymerase-Kettenreaktion. Die Methode ermöglicht die Vervielfältigung von DNA, auch wenn diese nur in sehr geringer Ausgangsmenge vorhanden ist. Das Verfahren basiert auf dem Prinzip einer enzymatischen DNA-Replikation, bei der eine thermostabile DNA-Polymerase verwendet wird. Ansatzpunkt der Polymerase sind kurze doppelsträngige Bereiche am Matrizenstrang, die sich durch komplementäre Bindung synthetischer Oligonukleotide, der sogenannten Primer, an der Zielsequenz ergeben. Man setzt zwei Primer ein, damit die Synthese des DNA-Strangs auch in gegenläufiger Richtung am komplementären Strang erfolgen kann. Voraussetzung ist, dass die Sequenz der Ränder des zu amplifizierenden Bereiches bekannt sind. Zuerst wird die doppelsträngige DNA bei C in zwei Einzelstränge denaturiert. Anschließend erfolgt während der Annealingphase die Bindung der Primer an die Einzelstränge und zwar immer am 3 - Ende des Strangs. Dabei hat jedes Primerpaar seine eigene Annealingtemperatur, in der Regel zwischen 40 C und 60 C, welche mittels einer PCR-Etablierung eruiert werden muss. Ausgehend vom freien 3 -Ende jedes Primers wird nun mithilfe der DNA-Polymerase und der dntp s (Desoxynukleotidtriphosphate) für jeden Einzelstrang ein komplementärer Strang synthetisiert. Die dntp s dienen hierbei als Bausteine für den neuen Strang. Das verwendete Enzym, die Taq-Polymerase, arbeitet bei 72 C und stammt aus dem hitzestabilen Bakterium Thermus aquaticus. Die Hitzestabilität gewährleistet, dass bei zyklischer Wiederholung der Schritte das Enzym nicht inaktiviert wird. An dieser Stelle beginnt der Zyklus von Neuem und man erreicht mit Wiederholungen des Ablaufs eine annähernd exponentielle Vermehrung der DNA. Das Standard-PCR-Schema ist in Tabelle 7 zusammengefasst.

25 Material und Methoden 19 Tabelle 7: Standard-PCR-Bedingungen 94 C/95 C 2' Denaturieren 94 C/95 C 30'' Primer-Annealing Annealing Temperatur 30-45'' Strangsynthese 72 C Synthesezeit 72 C 10' 35 Zyklen Legende: PCR= polymerase chain reaction Tabelle 8: Etablierte PCR-Bedingungen für P53AIP1 Exon MgCl 2 - Konzentration Syntheseszeit Die PCR wurde verwendet, um die Abschnitte der Probanden-DNA zu vervielfältigen, in denen die Gene P53AIP1 und DYRK2 liegen, um diese später sequenzieren zu können. Für jedes Exon von P53AIP1 und DYRK2 wurden zuerst in einer Etablierung mit einer Kontroll-DNA Synthesezeit, Annealing-Temperatur der Primer und benötigte MgCl 2 - Konzentration bestimmt. Nach Festlegung der PCR-Bedingungen wurde für jedes Exon ein Master Mix gemischt und pro Ansatz 2µl DNA des jeweiligen Probanden dazugegeben. Ein Ansatz diente als Leerwert. Im Thermocycler wurde die PCR nun gestartet. Tabellen 8 bis 12 zeigen die in der Etablierung bestimmten PCR-Bedingungen für P53AIP1 und DYRK2 und die Zusammensetzung der Ansätze. Für die PCR von P53AIP1 und Exon 3a, 3a1 und 3b von DYRK2 wurde die Taq- Polymerase verwendet. Für die GC-reichen Exons 1 und 2 von DYRK2 wurde die KAPA2G Robust Polymerase verwendet, da es mit der Taq-Polymerase nur unzufriedenstellende Ergebnisse gab. Annealing- Temperatur der Primer 1 1,5 mm 1' 54 C 2ABC/3AB 1,5 mm 2' 56 C 4AB 1,5 mm 2' 56 C Legende: PCR= polymerase chain reaction; p53aip1= p53-regulated apoptosis-inducing protein 1; MgCl 2 = Magnesiumchlorid

26 Material und Methoden 20 Tabelle 9: Etablierte PCR-Bedingungen für DYRK2 Exon MgCl 2 - Konzentration Syntheseszeit Annealing- Temperatur der Primer 1+2 1,5 mm 1'10'' 62 C 3a 2 mm 2' 55 C 3a1 2 mm 1' 55 C 3b 1,5 mm 1' 57 C Legende: DYRK2 = dual-specificity tyrosine-(y)-phosphorylation regulated kinase 2; MgCl 2 = Magnesiumchlorid Tabelle 10: PCR-Ansatz für P53AIP1, Exon 1, 2ABC/3, 4AB Komponente Volumen Ausgangskonzentration Endkonzentration H 2 O ad 50 µl PCR-Puffer (mit 1,5mM MgCl 2 ) 5,0µl 10x 1x dntp's Primer hin (forward) Primer rück (reverse) Taq-DNA- Polymerase 0,5µl je 20mM datp/dgtp/dctp/dttp je 0,2mM 1,25µl 100 pmol/µl 2,5 pmol/µl 1,25µl 100 pmol/µl 2,5 pmol/µl 0,2µl 5 U/µl 0,02 U/µl DNA 2µl 50 ng/µl 2 ng/µl Legende: PCR = polymerase chain reaction; p53aip1 = p53-regulated apoptosis-inducing protein 1; MgCl 2 = Magnesiumchlorid; dntp = Desoxynukleosidtriphosphat; datp = Desoxyadenosintriphosphat; dgtp = Desoxyguanosintriphosphat; dctp = Desoxycytidintriphosphat; dttp = Desoxythymidintriphosphat

27 Material und Methoden 21 Tabelle 11: PCR-Ansatz für DYRK2, Exon 1 und 2 Komponente Volumen Ausgangs konzentration Endkonzentration H 2 O ad 50µl - - KAPA2G Puffer B (mit 1,5mM MgCl 2 ) dntp's Primer hin (forward) Primer rück (reverse) KAPA2G Enhancer 1 KAPA2G Robust Polymerase genomische DNA 10,0µl 5x 1x 0,5µl je 20mM datp/dgtp/ dctp/dttp je 0,2mM 1,25µl 100 pmol/µl 2,5 pmol/µl 1,25µl 100 pmol/µl 2,5 pmol/µl 10,0µl 5x 1x 0,2µl 5U/µl 0,02 U/µl 2,0µl 50 ng/µl 2 ng/µl Legende: PCR = polymerase chain reaction; DYRK2 = dual-specificity tyrosine-(y)-phosphorylation regulated kinase 2; MgCl 2 = Magnesiumchlorid; dntp = Desoxynukleosidtriphosphat; datp = Desoxyadenosintriphosphat; dgtp = Desoxyguanosintriphosphat; dctp = Desoxycytidintriphosphat; dttp = Desoxythymidintriphosphat; KAPA2G = Enzymname

28 Material und Methoden 22 Tabelle 12: PCR- Ansatz für DYRK2, Exon 3a, 3a 1 und 3b Komponente Volumen Ausgangs konzentration Endkonzentration MgCl 2 zusätzlich nur bei Exon 3a und 3a1 1,0µl 25mM 0,5mM H 2 O ad 50µl - - PCR-Puffer (mit 1,5mM MgCl2) dntp's Primer hin (forward) Primer rück (reverse) Taq-DNA- Polymerase 5,0µl 10x 1x 0,5µl je 20mM datp/dgtp/ dctp/dttp je 0,2mM 1,25µl 100 pmol/µl 2,5 pmol/µl 1,25µl 100 pmol/µl 2,5 pmol/µl 0,4µl 5 U/µl 0,04 U/µl genomische DNA 2,0µl 50 ng/µl 2ng/µl Legende: PCR = polymerase chain reaction; DYRK2 = dual-specificity tyrosine-(y)-phosphorylation regulated kinase 2; MgCl 2 = Magnesiumchlorid; dntp = Desoxynukleosidtriphosphat; datp = Desoxyadenosintriphosphat; dgtp = Desoxyguanosintriphosphat; dctp = Desoxycytidintriphosphat; dttp = Desoxythymidintriphosphat Die für die PCR verwendeten Primer sind in Tabelle 2 in Kapitel dargestellt. Bei der Erstellung der Primer mithilfe der Software Primer3Plus wurde darauf geachtet, dass die Annealing-Temperatur circa C beträgt. Die Primer sollten eine optimale Länge von circa 90 (60-150) Basenpaare haben. Außerdem wurde versucht schon bekannte SNPs bei der Erstellung der Primer zu umgehen, um eine schlechte Bindung zu vermeiden. Nach Erstellung der Primer wurde mithilfe der Software BLAST überprüft, welche Sekundärstrukturen die Basen der Primer ausbilden. Dabei sollte vermieden werden, dass die Primer untereinander oder mit sich selbst feste Faltstrukturen ausbilden und somit die Funktion des Primers eingeschränkt wird. Auch bei der HRM und der TaqMan Methode wird eine PCR durchgeführt, für die extra Primer erstellt wurden. (siehe Punkt 2.3.5).

29 Material und Methoden Agarose-Gelelektrophorese Mithilfe der Agarosegelelektrophorese gelingt es, DNA-Fragmente nach ihrer Größe aufzutrennen. Agarose ist ein Polysaccharid, das aus Meeresalgen gewonnen wird. Durch seine zahlreichen Hydroxylgruppen können sich Agarosemoleküle über Wasserstoffbrückenbindungen miteinander vernetzen,so dass ein Gel mit großen Poren und Festigkeit entsteht. Bei der Elektrophorese macht man sich die Eigenschaft zu Nutze, dass Nukleinsäuren negativ geladen sind. Sie wandern somit im angelegten elektrischen Feld zur Anode, dem Pluspol. Wie weit die einzelnen DNA-Fragmente dabei wandern, hängt von der Anzahl ihrer Basenpaare ab, da diese sterisch daran gehindert werden. Zum Ablesen der Produktgröße lässt man parallel zu den Proben einen Längenstandard mitlaufen. Die Wanderungsgeschwindigkeit hängt außerdem von der angelegten Stromstärke und der Konzentration des Agarosegels ab. Die aufgetrennten DNA-Fragmente werden im UV- Licht sichtbar gemacht, da dem Gel ein floureszierender Farbstoff, Ethidiumbromid, zugesetzt wurde und dieser zwischen die Basenpaare interkaliert. Nach der Polymerase-Kettenreaktion diente die Gelelektrophorese zum Überprüfen der PCR-Produktgröße und spezifität. Man verwendete ein 1,5%iges Gel, wofür 3g Agarose in 200ml 1xTBE-Puffer durch Aufkochen gelöst wurde. Nach kurzem Abkühlen und Zugabe von 12µl Ethidiumbromidlösung wurde damit einen Gelschlitten befüllt. Nachdem das Gel fest geworden war, wurden die eingesetzten Kämme herausgezogen und das Gel in eine Elektrophoresekammer, gefüllt mit TBE-Puffer, gelegt. Als Längenstandard wurde der Phage PhiX DNA/Hae-III Marker verwendet. Die einzelnen PCR-Produkte wurden mit 2µl Ladepuffer gemischt in die Taschen des Gels pipettiert. Durch Anlegung einer 200 Volt Spannung wurde die Elektrophorese gestartet. Nach min konnte man die PCR- Produkte unter UV-Licht betrachten und Größe und Spezifität der Produkte überprüfen.

30 Material und Methoden Aufreinigung der PCR-Produkte Vor einer Sequenzierung von PCR-Produkten müssen diese erst aufgereinigt, das heißt von Resten des PCR-Ansatzes befreit werden. Bei der Exo1/SAP Methode werden die Primer im PCR-Ansatz von der Exonuklease 1, welche nur einsträngige DNA als Substrat akzeptiert, abgebaut. SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase) spaltet von den nach der PCR übriggebliebenen dntps die Phosphatreste ab und verhindert damit ihren weiteren Einbau. Es wurden 2,5µl SAP (1 U/µl) zu 2,5µl Exo1 (2,5 U/µl) pipettiert. Die Stammlösung Exo1 lag in einer 10 U/µl Konzentration vor. Sie wurde für die Aufreinigung im Verhältnis 1:4 mit Wasser verdünnt. Zu diesem Gemisch wurden 5µl PCR-Produkt hinzugegeben und bei 37 C 45 min im Thermocycler inkubiert. Um die Enzyme anschließend zu inaktivieren wurde für 15 min auf 72 C erhitzt Sequenzierung Die enzymatische Kettenabbruchmethode, entwickelt von Frederick Sanger, ist heute noch Grundlage der Sequenzierung, auch wenn sie modifiziert und automatisiert wurde. Das Prinzip gleicht dem der PCR, allerdings wird bei der Sequenzierung nur ein Primer verwendet. Als erstes werden die DNA-Abschnitte in einem Zyklus von Denaturierung, Annealing und Verlängerung amplifiziert. Dabei werden dem Sequenzieransatz nicht nur normale dntps wie bei der PCR, sondern auch ddntps (ddatp, ddttp, ddgtp,ddctp), in einem bestimmten Verhältnis zugegeben. Diese ddntps besitzen keine 3'- Hydroxygruppe, die für die Verknüpfung mit der Phosphatgruppe des nächsten Nukleotids notwendig ist. Wird ein ddntp anstatt einem dntp bei der Amplifikation eingebaut, kommt es zum Kettenabbruch und eine weitere Verlängerung der DNA ist nicht mehr möglich. Das Verhältnis von dntps zu ddntps gewährleistet, dass sich die Kettenabbrüche über das ganze zu sequenzierende Stück verteilen und unterschiedlich lange Stücke entstehen. Diese Fragmente laufen anschließend in automatisierten Sequenziergeräten durch eine mit Polymer gefüllte Kapillare hindurch und werden elektrophoretisch nach ihrer Länge aufgetrennt. Mithilfe der Kapillarelektrophorese ist es

31 Material und Methoden 25 möglich, DNA-Fragmente zu trennen, die sich in ihrer Länge nur in einer Nukleinsäure unterscheiden. Da die ddntps zusätzlich fluoreszenzmarkiert sind, wobei jede Farbe eine der vier Basen repräsentiert, können die Fragmente kurz vor der positiven Elektrode mit einem Laser beleuchtet werden und ein Detektor misst die Fluoreszenz. Jedes ddntp sendet dabei Licht einer bestimmten Wellenlänge aus. Mit Hilfe einer Software wird jeder Wellenlänge beziehungsweise Farbe die entsprechende Nukleinsäure zugeordnet. Somit erhält man die Primärsequenz des gewünschten DNA-Abschnitts. Für die Sequenzreaktion wurden zu 1µl Big Dye Terminator v3.1 und 1µl 5x Sequenzpuffer 0,5µl des jeweiligen Sequenzierprimers pipettiert. Für jeden Primer wurde ein eigener Ansatz gemischt. Die verwendeten Sequenzierprimer sind in Kapitel in Tabelle 2 aufgeführt. Zu diesen Ansätzen wurden 1,5-2,5µl des aufgereinigten PCR- Produkts dazugegeben. Im Thermocycler wurde die Sequenzreaktion gestartet. Das dabei verwendete Sequenzierprogramm ist aus Tabelle 13 ersichtlich. Tabelle 13: Ablauf der Sequenzierreaktion 96 C 1' 96 C 10'' 55 C 10'' 25 Zyklen 60 C 3' Nach der Sequenzreaktion erfolgte eine Aufreinigung mittels Alkoholischer Fällung, um überschüssige fluoreszierende Nukleotide zu entfernen. Dazu wurde in einem ersten Schritt das Produkt auf eine 96-Well-PCR-Platte, die später in den 3100ABI PRISM Genetic Analyzer gestellt wurde, übertragen und 3µl Natriumacetat, 25µl H2O und 75µl Ethanol absolut in jedes Well dazu gegeben. Nach Abdecken mit metallbeschichteter Folie (Adhesive PCR Foils Seals, peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen) und Vortexen erfolgte 20 min lang eine Inkubation bei Raumtemperatur und eine 15 minütige Zentrifugation bei 3000 rpm. Nach Abkippen des Überstands wurde anschließend noch mit 50 µl 70% Ethanol gewaschen, wiederum gevortext und 15 min bei 3000 rpm zentrifugiert. Danach wurde wiederum der Überstand abgekippt und die Platte über Kopf bei 200 rpm abzentrifugiert. Das DNA-Pellet wurde nun für den 3100ABI PRISM Genetic Analyzer

32 Material und Methoden 26 vorbereitet und dazu in Hi-Di Formamide (highly deionized formamide, Applied Biosystems) gelöst und für 15 min bei 37 C und für weitere 3 min bei 95 C im Thermocycler inkubiert. Im ABI PRISM Genetic Analyzer wurden die DNA-Fragmente elektrophoretisch aufgetrennt und die Fluoreszenz jedes Moleküls gemessen. Die Data Collection Software von Applied Biosystems wandelte die ausgesendeten Wellenlängen in eine digitale Form um. Mit der Sequencing Analysis 3.7 ABI PRISM Software wurden die gewonnenen Daten in einer ersten Analyse auf ihre Qualität und Verwertbarkeit überprüft. Mit der SeqScape v2.5 Software von Applied Biosystems, die eine Gegenüberstellung mit einer Referenzsequenz erlaubt, wurden in einer zweiten Analyse die Probanden auf Mutationen oder Varianten überprüft und die Genotypen dokumentiert HRM (High Resolution Melting)/ Schmelzkurvenanalyse Die Technik der Schmelzkurvenanalyse soll es ermöglichen, Mutationen und Polymorphismen in doppelsträngiger DNA aufzuspüren und eine Genotypisierung vorzunehmen. Durch die Automatisierung dieser Methode können sehr viele DNA-Proben gleichzeitig untersucht werden. Ausgangsmaterial ist das PCR-Produkt der zu untersuchenden Sequenz. Dem PCR-Ansatz wird ein interkalierender fluoreszierender Farbstoff zugegeben, der sich in doppelsträngige DNA einlagert. Der Amplifikation folgt ein Dissoziationsschritt. Hierbei wird sehr langsam von circa 40 C auf 95 C aufgeheizt. Dabei schmelzen die DNA-Doppelstränge und der Farbstoff wird freigesetzt und fluoresziert nicht mehr. Durch die Messung der Abnahme der Fluoreszenz über den Anstieg der Temperatur ergeben sich die spezifischen Schmelzkurven des PCR-Produkts. Jeder Genotyp besitzt charakteristische Schmelzeigenschaften, da die Basenpaare unterschiedlich schnell dissoziieren. Bei Heterozygoten kommt es zur Ausbildung von Heteroduplexprodukten, die bei niedrigeren Temperaturen schmelzen als die Produkte homozygoter Individuen. Abbildung 2 zeigt beispielhaft Schmelzkurven von homozygoten und heterozygoten DNA-Proben. Die rot dargestellten Kurven sind durch das Abschmelzen bei schon niedrigeren Temperaturen und dem flachen Kurvenverlauf als Heterozygote zu identifizieren. Homozygote (grüne Kurven) schmelzen später und in einem steileren Verlauf ab. Die Kurven können auch im

33 Material und Methoden 27 sogenannten Difference Plot betrachtet werden (siehe Abbildung 2 unten). Hier wird der Unterschied der Fluoreszenzabnahme zwischen den einzelnen Proben gegenüber der Temperatur aufgetragen. Abbildung 2: Beispiele für Schmelzkurven von homo- und heterozygoten Genotypen, unteres Bild: Darstellung der Kurven im Difference Plot; Legende: rot = heterozygot; grün = homozygot Polymorphismen/SNPs und Mutationen in der Sequenz verändern die Schmelzkurven. Damit können mit der Schmelzkurvenanalyse verschiedene Genotypen, Mutationen und Polymorphismen unterschieden werden. In einigen Fällen können manche Genotypen nicht klar unterschieden werden. Um die Unterscheidung zwischen den homozygoten Individuen zu optimieren, besteht die Möglichkeit Proben mit unbekanntem Genotyp mit Proben eines bekannten Wildtyps zu

34 Material und Methoden 28 mischen. Entstehen bei der Amplifikation Doppelstränge aus Wildtyp und Mutation, so entstehen Heteroduplexe, die, wie oben erwähnt, früher als Homozygote abschmelzen. Liegt keine Mutation vor, entstehen nur Homoduplexe, die alle die gleiche Schmelzkurve zeigen. Eine weitere Möglichkeit zur besseren Differenzierung der Kurven ist die Zugabe eines unmarkierten Oligonukleotids zum Reaktionsansatz. Diese Methode orientiert sich an dem gerade beschriebenen Prinzip der Heteroduplexbildung. Das zugegebene Oligonukleotid ist komplementär zu dem Genotyp der Variante/Mutation. Es bindet während der PCR an einen Strang. Dadurch ensteht ein zweiter vorangehender Peak (Schmelzbereich zwischen 65 und 72 C). Bei der Auswertung wird dann sowohl die Kurve des PCR-Produkts (siehe Abbildung 2 oben, Schmelzbereich zwischen 83 und 88 C) als auch die des Oligonukleotids angeschaut. Die Schmelzkurve des Produkts mit Oligonukleotid trennt zum Beispiel zwei verschiedene homozygote Genotypen, die in der Kurve des PCR-Produkts nicht zu unterscheiden sind. Abbildung 3 zeigt beispielhaft den sogenannten Differenceplot des Oligonukleotidpeaks. Homozygote für das Allel X (grüne Kurven) sind nun klar von den Homozygoten für das Allel Y (blaue Kurven) zu unterscheiden. Bei Herstellung des Oligonukleotids sollte darauf geachtet werden, dass dessen Schmelztemperatur 5 C über der der Primer liegt. Abbildung 3: Beispiel einer Schmelzkurve des Oligonukleotids, dargestellt im Difference Plot Legende: grün = Homozygote für Allel X; blau = Homozygote für Allel Y; rot = Heterozygote Als Protokoll für die Schmelzkurvenanalyse wurde die Anleitung von Applied Biosystems herangezogen. Daraus wurde die Zusammensetzung des MasterMix und das Programm für die Amplifikations-und Dissoziationsschritte entnommen. Bei der Zusammenstellung der