Transformation und molekulargenetische Analyse der Diatomee Cylindrotheca fusiformis

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1 Biochemisches Grosspraktikum der Universität Regensburg Teil C: Molekularbiologie Transformation und molekulargenetische Analyse der Diatomee Cylindrotheca fusiformis Stand Dezember 07

2 Inhalt 1. Einleitung Allgemeines Praktisches Arbeiten Klonierung eines Resistenz-Gens zur Diatomeen-Transformation Plasmid Isolierung [Machery Nagel; NucleoSpin Plasmid] AccI/KpnI -Verdau von ppδ bzw. pblen Ligation: ppδ (AccI/KpnI) mit blen (AccI/KpnI) Transformation in E. coli Kolonie-PCR (Identifikation von Klonen, die das ble-gen enthalten) Vorbereiten des Plasmids ppδblen für die Diatomeen-Transformation Transformation von C. fusiformis Molekulargenetische Analyse einer C. fusiformis Transformante RT-PCR Analyse von CfWT und der Transformante Cfε und Klonierung des cdna Amplikons Sequenzierung des PCR-Produktes Southern Blot mit restriktionsverdauter genomischer DNA von Cf WT und der Transformante Cfε Quantitative PCR mit genomischer DNA von CfWT und Cfε Anhang Zusammensetzung der verwendeten Lösungen DNA Marker DNA Sequenzen Literatur: W(WW)issenswertes...28

3 1. Einleitung 1.1 Allgemeines Ziel dieses Praktikumteils ist es, einen Einblick in molekularbiologisches Arbeiten und Routinetechniken zu geben. Das Spektrum umfasst Klonierungen in E. coli; präparative Isolierung eines Plasmides und anschliessende Transformation dieser transgenen DNA in Diatomeen. Im zweiten Teil wird eine molekularbiologische Analyse einer Diatomeenmutante durchgeführt. Begleitend zum Praktikum finden Seminare statt, die die jeweiligen Themenbereiche näher erläutern sollen. Diese Seminare werden sowohl von Assistenten, als auch Praktikumsteilnehmern abgehalten. Die Seminarthemen sind flexibel und können am allgemeinen Interesse ausgerichtet werden. Die folgenden Beispiele dienen zur Orientierung: Enzyme der Molekularbiologie sowie die durch sie katalysierten Reaktionen Molekularbiologische Modellorganismen PCR: Anwendungen/Methoden Hybridisierungstechnologien: Anwendungen/Methoden Nukleinsäuren: Arten/Charakteristika/Funktionen... Am Ende des Praktikums werden die Ergebnisse in Form eines Protokolles zusammengefasst. Das Protokoll wird wie folgt strukturiert: Einleitung Kurze Beschreibung/Einordnung der verwendeten experimentellen Systeme und Betrachtung des "Projektes" im "grösseren Rahmen" der molekularbiologischen Analyse von Diatomeen. Experimenteller Teil Das experimentelle Ziel eines jeden Teilschrittes wird benannt. Das Prozedere wird beschrieben, ohne dass auf die im Skript angegebenen Details (z.b. Mengen-/Temperaturangaben, Zentrifugenzeiten) eingegangen wird [kein Kopieren/Einfügen]. Auf die verwendeten Standardprotokolle wird verwiesen und diese zusammen mit den benutzten Reagentien im Annex vermerkt. Falls die Vorgaben im Skiptum geändert werden, muss dieses unbedingt festgehalten werden (bitte auch den Grund nennen, warum das Protokoll verändert wurde). Alle (wichtigen) Beobachtungen werden notiert und (Teil-)Ergebnisse in Form der Originaldaten dokumentiert. Zusammenfassung Kurze Beurteilung der durchgeführten Arbeiten und Diskussion, wie (oder wenn nicht, warum nicht) die experimentellen Ziele erreicht wurden. Annex Enthält Standardprotokolle, Reagentien, Pufferzusammensetzungen etc. 1

4 1.2 Praktisches Arbeiten Puffer und Lösungen aus Eigenproduktion Zu Beginn des Praktikums werden Puffer und Lösungen angesetzt. In der Vergangenheit zeigte sich, dass diese (leider nur mässig aufregende) Aufgabe von den Studenten in einer gemeinsamen Anstrengung unternommen wurde. Leider führten diese "Gemeinschaftsprojekte" immer wieder zum kollektiven Scheitern ganzer Praktikumsteile, die im Nachhinein wiederholt werden mussten. Die korrekte Pufferzusammensetzung ist essentiell für das Gelingen der Experimente. Jede Gruppe muss ihre eigenen Puffer ansetzen Ausgegebene Stocklösungen Im Rahmen des Praktikums werden von den Assistenten spezielle Stocklösungen und Reagentien ausgegeben. Hierbei handelt es sich oftmals um Konzentrate: Diese müssen entsprechend verdünnt werden, um die richtigen Konzentrationen in den Reaktionsansätzen zu erhalten. Bei uneindeutiger Beschriftung der ausgegebenen Materialien bitte vor dem Pipettieren die Assistenten fragen Steriles Arbeiten Alle sterilen Arbeiten (inklusive Plattieren von transformierten Bakterien) werden an der Sterilbench durchgeführt. Wenn Vorstufen (z.b. Ligationsansätze) an der Laborbank angesetzt werden sollte diese zuvor abgewischt und mit 70%igem Ethanol gesäubert werden Pipettierarbeiten In vielen Praktikumsteilen werden sehr sensitive Methoden verwendet (z.b. PCR/Transformation) bei denen eingeschleppte Kontaminationen die erhaltenen Resultate negativ beeinflussen. Beim Pipettieren aus Stocklösungen müssen stets neue Pipettenspitzen verwendet werden. Wurde mit der Pipettenspitze vor dem Pipettiervorgang (unbeabsichigt) die Laborbank oder andere Gegenstände berührt, sollte diese verworfen werden Beschriftungen Zu Beginn des Praktikums sollte sich jede Gruppe eine eindeutige Beschriftungsstrategie für die im Praktikumsverlauf anfallenden Proben einfallen lassen. Dadurch lassen sich Vertauschungen und Verluste vermeiden. 2

5 2 Klonierung eines Resistenz-Gens zur Diatomeen-Transformation Für die Synthese des Resistenz-Gens stehen zwei Plasmide (ppδ und pblen) zur Verfügung. Das Plasmid ppδ enthält einen Diatomeen-spezifischen Promotor Pδ (Pdelta; ca. 950 bp, Abb. 1A). Plasmid pblen trägt das bakterielle ble Gen (BLE; ca. 380 bp), welches Resistenz gegen das Antibiotikum Zeocin vermittelt (Abb. 1B). N bezeichnet eine Diatomeen-spezifischen 3'- nicht transkribierte Region (N; ca. 575 bp), die unmittelbar auf das Stop-Codon des ble-gens folgt und den Terminator des C. fusiformis fruα2 Gens enthält. Aus pblen wird nach Restriktionsverdau das DNA-Fragment blen isoliert und mit dem durch entsprechende Restriktionsenzyme verdauten ppδ Vektor ligiert (Abb. 1C). Das Ligations- Produkt (ppδblen) wird in E. coli kloniert, anschliessend isoliert und für die Transformation der Diatomee C. fusiformis verwendet. C. fusiformis-klone, die erfolgreich transformiert wurden und das ble-gen exprimieren, können auf Zeocin-haltigem Medium wachsen. A Pdelta B Acc I (1067) ampr ppdelta 5312 bp ampr pblen 4865 bp Acc I (1067) BLE N KpnI (2023) C Kpn I (2470) BamHI (104) ClaI (124) pdelta X031 ampr ppdelta blen 4865 bp Acc I (1067) BLE BLE6 ClaI (1664) N KpnI (2023) Eco RI (2031) ClaI (2038) Abb. 1 Plasmidkarten der Ursprungsvektoren (A,B) sowie des Zielplasmides (C) mit den relevanten Elementen (im Text beschrieben), Restriktionsenzymschnittstellen und Primerbindungsstellen. ampr codiert für das Enzym β-lactamase, welches plasmidtragenden Bakterien Ampicillinresistenz verleiht. 3

6 2.1 Plasmid Isolierung [Machery Nagel; NucleoSpin Plasmid] 1. für jeden der beiden Klone (ppδ [GK16] bzw. pblen [GK17]) 10 ml ü.n.-kultur ( 37 C / 190 Upm, in 2xYT/Amp-Medium) 2. Die Zellen werden für 10 min bei 2800xg ml und 4 C pelletiert 3. Überstand vollständig abnehmen 4. siehe Protokoll im Anhang 5. Photometrische Bestimmung der DNA-Konzentration und des Verhältnisses E 260 /E AccI/KpnI -Verdau von ppδ bzw. pblen 1. 2 µg ppδ bzw. 5 µg pblen werden in 1x NEB4 Puffer inklusive 0.1mg/ml BSA mit 15 U KpnI (ppδ) / 30 U KpnI (pblen) und + 15 U AccI (ppδ) / 30 U AccI (pblen) in einem Gesamtvolumen von 100µl verdaut C / 2h 3. je 10 µl der Verdaue auf 1% Agarosegel analysieren; falls Verdaue vollständig, dann Ethanol-Fällung: 1. zu wässriger Phase 1/10 Vol. 3M NaAc ph 5,2 + 2,5 Vol. EtOH zugeben 2. Durchmischen wie oben min, 20 C 4. zentrifugieren: 10min / 14000Upm / 4 C, Überstand verwerfen 5. zu Pellet 100µl 70% EtOH pipettieren (Pellet möglichst nicht aufwirbeln) 6. 5min zentrifugieren bei 4 C, Überstand verwerfen 7. Pellet bei 37 C trocknen 8. in 30 µl TE lösen; durch Elektrophorese (1% Agarose) auftrennen (je Verdau-Ansatz auf drei Taschen verteilen) 9. 3,9 kb Bande (ppδ) bzw. 950 bp Bande (blen) ausschneiden (nur 366nm UV-Lampe zur Detektion verwenden!) und mittels QiaExII (10 µl Glasmilch) isolieren (Elution in 10 µl TE) [siehe Protokoll im Anhang] Mengenabschätzung von 1/10 des Eluats mittels Agarose-Gelelektrophorese 2.3 Ligation: ppδ (AccI/KpnI) mit blen (AccI/KpnI) L1 L2 blen (AccI/KpnI) 25 ng ---- ppδ (AccI/KpnI) 100 ng 100 ng + 10x T4-DNA-Ligase-Puffer 2 µl 2 µl + 10 mm ATP 2 µl 2 µl + T4 DNA-Ligase 2 U 2 U + H2O ad 20 µl ad 20 µl bei 12 C ü.n. inkubieren (bei klebrigen Enden kann alternativ eine Ligation bei RT für 1-2h auf der Laborbank durchgeführt werden) 2.4 Transformation in E. coli Herstellung kompetenter Zellen: 1. Vorkultur von E. coli DH5α [GK7]in 2 ml LB Medium über nacht bei 170 Upm / 37 C 2. damit Hauptkultur (2x 50 ml LB in 250 ml Kolben) animpfen 3. bei mind. 170 Upm / 37 C schütteln bis OD 578 = 0,5 (Wachstumsdauer ca. 2h) 4. in steriles 50 ml Falconröhrchen gießen und zentrifugieren: 7 min / 2000 g / 4 C 5. Überstand verwerfen 6. Zellen in 15 ml TfbI resuspendieren (kräftig vortexen!) min / 0 C 8. Zentrifugieren: 5 min / 1500 g / 4 C 9. Überstand verwerfen 10. Zellen in 2 ml TfbII resuspendieren (vorsichtiges Schwenken im Eiswasser!), µl Aliquots in sterile Eppendorf- Gefäße (mit flüssigem N2 vorgekühlt) abfüllen (Zellen auf Eis stehen lassen!), sofort in fl. N2 einfrieren und bei - 80 C lagern. 4

7 2.4.2 Transformation: µl kompetente E. coli DH5α (in der Hand auftauen, dann sofort auf Eis) in eisgekühlte E-Cups abfüllen [50 µl kompetente E. coli (vom Assistenten ausgegeben) als Kontrolle nur mit 1 ng ppδ transformieren (siehe 2)] µl Ligationsansatz L1 bzw. L2 (Negativ-Kontrolle) bzw. 1 ng ppδ (Positiv-Kontrolle) min / 0 C sec / 42 C 5. 2 min / 0 C µl SOB Medium ,5 µl 2M MgCl 2 (steril!) µl 1M Glucose (steril!) min / 37 C 10. für L1 bzw. L2 Ansatz je 2 Platten (100 µl bzw. Rest durch Zentrifugation [5 min.; rpm ( xg)] pelletieren und in 100 µl Überstand aufnehmen) auf LB/Amp-Platten ausplattieren; von der Positiv-Kontrolle nur 11. 1x 100 µl ausplattieren 12. ü. N. / 37 C der Rest der Ligation wird in einem 1% Agarosegel zusammen mit den gelgereinigten ppδ blen Fragmenten analysiert die Positivkontrollen werden dazu benutzt die cfu (die colony forming units) pro µg transformierter DNA zu bestimmen [Mass für die Kompetenz der Zellen]. 2.5 Kolonie-PCR (Identifikation von Klonen, die das ble-gen enthalten) x-PCR-Mix (für elf 50 µl Reaktionen): 27,5 µl l 2mM dntp-mix (enthält je 2mM datp, dctp, dgtp, dttp) 110 µl 5x PCR Puffer (wird gestellt) 27,5 µl 10 pmol/µl X031 primer 27,5 µl 10 pmol/µl BLE6 primer 22 µl DMSO X µl Taq Pol. (Betreuer fragen) ad 275 µl Wasser im Eis aufbewahren 1. Für 10 Klone: ca. die Hälfte eines Klons mit sterilem Pipettenspitzen von Transformationsplatte aufnehmen, in 25 µl Wasser (in PCR-Cup) resuspendieren und an der Pipettenspitze verbliebene Zellen auf LB/Amp-Platte auftragen. Platte ü.n. inkubieren. 2. Cups: 5 min 95 C, sofort auf 0 C, bei 4 C kurz zentrifugieren (Adapter!) µl 2x Mix PCR Programm Proben auf Eis halten, bis der Thermoblock der PCR Maschine 94 C erreicht hat Probengefässe in den Block setzen Schritt 1 Denaturierung 2 min, 94 C 2 Denaturierung 30 sec, 94 C 3 Annealing 30 sec, 55 C 4 Extension 45 sec, 72 C 5 Zyklen gehe 40x zurück zu 2 6 Extension 7 min, 72 C 7 Lagerung 4 C Je 10 µl der Ansätze auf 1,5% Agarose-Gel analysieren (erwartetes Produkt: 584 bp) 5

8 2.6 Vorbereiten des Plasmids ppδblen für die Diatomeen-Transformation Plasmidisolierung [Machery Nagel; NucleoSpin Plasmid]: 1. Je 10 ml ü.n. Kultur (LB/Amp) von 2 in der Kolonie-PCR positiven Klonen. Isolierung der Plasmide von jeweils 5 ml Kultur mittels NucleoSpin-Kit (siehe Protokoll im Anhang) 2. Photometrische Bestimmung der DNA-Konzentration und des Verhältnisses E 260 /E Falls DNA Konzentration < 1 µg/µl: Ethanol-Fällung: 1. wie unter beschrieben 2. Pellet bei 37 C trocknen 3. in x µl 10mM TRIS-Cl ph8 auflösen, um eine 1 µg/µl Lösung zu erhalten 4. 2,5 µl Plasmid-Lösung entnehmen 5. +2,5 µl TE µl 6x DNA-Probenpuffer (DNA-PP) Mengenabschätzung im 1% Agarosegel (1x TAE) Restriktionsanalyse (siehe 2.2) In unabhängigen 20 µl Ansätzen (Endvolumen) werden jeweils 0,5 µg Plasmid-DNA (für a und b) bzw 1 µg Plasmid-DNA (für c) wie folgt verdaut: 5 U KpnI (1x NEB1 + 0,1mg/ml BSA) 4,9 kb Bande 5 U BamHI / 5 U EcoRI in EcoRI Puffer mit 0,1 mg/ml BSA 1,9 kb Bande + 3,0 kb Bande 10 U ClaI in NEB4 + BSA (100 mg/ml) 0,35kb + 1,55 kb + 3,0 kb Bande Adsorption der Plasmid-DNA an Wolfram-Partikel Waschen der Wolfram-Partikel: mg Wolfram-Partikel in 500 µl Ethanol p.a. resuspendieren 2. 1 min zentrifugieren 3. Pellet in 250 µl Ethanol p. a. resuspendieren min vore-texen 5. 1 min zentrifugieren 6. Pellet 3x mit jeweils 250 µl sterilem H 2 O waschen (jeweils resuspendieren, 1 min zentrifugieren), nach letztem Zentrifugieren in 150 µl H 2 O resuspendieren Suspension in 50 µl Aliquots aufteilen (sterile 1,5 ml Cups) Beschichtung: 1. zu je 50 µl Aliquot unter kontinuierlichem vore-texen zugeben: 5 µl 1 µg/µl Plasmid-DNA 50 µl 2,5 M CaCl 2 (steril) 20 µl 0,1 M Spermidin (freie Base, steril) 2. anschliessend 3 min vore-texen sec zentrifugieren, Überstand vollständig entfernen 4. Pellet in 250 µl Ethanol p. a. resuspendieren 5. 1 min vore-texen sec zentrifugieren, Pellet in 50 µl Ethanol p. a. resuspendieren Suspension bis zur Transformation auf Eis aufbewahren 6

9 2.7 Transformation von C. fusiformis Schematische Darstellung des zur Transformation verwendeten BioListic Systems (PDS- 1000/He-System) rupture disk rupture disk macro carrier macro carrier stopping screen stopping screen Vorbereiten der Zellen C. fusiformis Wildtyp-Zellen ernten: 1. pro Gruppe auf je 2 ASW-Platten je Zellen auftragen, dazu: 2. Zelldichte der Kultur bestimmen (Zählkammer) Zellen in sterilem 50 ml Falcon 10 min bei 2800 g, RT zentrifugieren 4. Pellet in wenig ASW-Medium resuspendieren 5. jeweils die Hälfte der Zellsuspension in zentraler Region (Ø ca. 5 cm) einer ASW-Platte ausstreichen 6. ca. 30 min antrocknen lassen (Sterilbank) Beschiessen der Zellen Vorbehandlung: 1. "Rupture disc" und "Microcarrier-Plättchen" in Ethanol p. A. einlegen, Ethanol abschütteln und unter Sterilbank in steriler Petrischale stehend trocknen lassen; Stopping screen und Microcarrier-Halterung 4 h bei 200 C ausglühen 2. zentralen Bereich eines "Microcarrier-Plättchens" mit 10 µl Wolfram-Partikeln (DNA beschichtet) möglichst gleichmässig beschichten 10 min trocknen lassen 3. Microcarrier-Plättchen in Halterung einbauen ("Stopping-Screen" nicht vergessen!) 4. "Rupture disk" in "Kanone" [Biolistic Particle-Delivery-System PDS-1000/He-Particle-Gun (Firma BioRad)] einbauen 5. Abstand Rupture disc/stopping screen = 1,5 cm 6. Agarplatte in Innenraum der "Kanone" legen; Abstand Rupture disc/agarplatte = 7 cm 7. Apparatur evakuieren 8. mit He als Druckgas die Platte mit 1100 psi,1350 psi oder 1550 psi beschießen 9. Apparatur auf Atmosphärendruck bringen und Agarplatte entnehmen h im Kulturraum (18 C) bei Dauerlicht inkubieren Selektion Zeocin-resistenter C. fusiformis Zellen 1. Jeweils zwei Platten (eine Gruppe) mit ASW-Medium abspülen, sodaß am Ende ca. 1 ml Zellsuspension erhalten wird. 7

10 2. 1/5 der Zellsuspension, ca. 200 µl auf 1 Platte ASW+Zeocin (1mg/ml) ausstreichen (entspricht ungefähr 10 7 Zellen). 3. ca. 7 Tage / 20 C im Licht inkubieren 4. 6 unabhängige Klone einzeln mittels Zahnstocher "picken" und damit jeweils 1,5 ml ASW+1mg/ml Zeocin Medium auf Titerplatte animpfen; parallel dazu 1 Well mit der Transformante Cfε animpfen und 1 Well (ASW ohne Zeocin!) mit C. fusiformis Wildtyp (CfWT) animpfen ca. 6 Tage / 20 C im Licht inkubieren PCR Analyse Zeocin-resistenter Zellen 1. Sobald Titerplatten-Kulturen angewachsen sind (nach ca. 6 Tagen), jeweils 1 ml Zellsuspension entnehmen 2. in 1,5 ml E-Cup abzentrifugieren (3 min, Tischzentrifuge) 3. Überstand bis auf 200 µl abnehmen, mit dem verbleibenden Überstand die Cup-Innenwand gut abspülen 4. zentrifuguieren wie oben, Überstand vollständig abnehmen 5. Pellet durch auf-und abpipettieren in 20 µl DNA-Lyse-Puffer (siehe Anhang) resuspendieren 6. 5 min 95 C, anschliessend sofort mit 200 µl 100 mm Tris HCl ph 7,5 verdünnen 7. 5 min zentrifugieren, 1 µl des Überstandes + 49 µl PCR-Mix, kurz "vore-texen" 8. sofort in Thermocycler / 55 C stellen PCR-Mix (für neun 50 µl Reaktionen): kurz nach Zell-Lyse ansetzen und auf Eis stehend aufbewahren 22,5 µl 2mM dntp-mix 90 µl 5x PCR Puffer 22,5 µl X031 primer (10 pmol/µl) 22,5 µl BLE6 primer (10 pmol/µl) 11,5 µl DMSO 4,5 µl Taq Pol 267,5 µl H2O PCR Programm: Proben auf Eis halten, bis der Thermoblock der PCR Maschine 94 C erreicht hat Probengefässe in den Block setzen Schritt 1 Denaturierung 2 min, 94 C 2 Denaturierung 30 sec, 94 C 3 Annealing 30 sec, 55 C 4 Extension 45 sec, 72 C 5 Zyklen gehe 40x zurück zu 2 6 Extension 7 min, 72 C 7 Lagerung 4 C Gelelektrophorese (1,5% Agarose) von je 10 µl Ansatz (erwartetes Produkt: 584 bp) 8

11 3 Molekulargenetische Analyse einer C. fusiformis Transformante In einem vorangegangenen Transformationsexperiment wurde C. fusiformis mit dem fruε-gen der Diatomee Navicula pelliculosa transformiert (codiert für das Zellwandprotein ε-frustulin). Mittels Southern Blot und quantitativer PCR soll überprüft werden, ob und wieviele Kopien des fruε-gens in das Genom von C. fusiformis integriert wurde. Um nachzuweisen, dass das fruε- Gen in der Transformante transkribiert und die prä-mrna (enthält drei Introns) korrekt prozessiert wird, werden RT-PCR-Analysen durchgeführt und resultierende PCR-Produkte kloniert und sequenziert. A intron 1 R16 NcoI (351) exon 2 fru epsilon X008 exon 1 R17 X013 intron 2 exon 3 intron 3 exon 4 EcoRI (1408) frustulin 1450 bp fru alpha 2 fru alpha 2 B fru alpha 2 fru alpha 2 fru alpha 2 fru alpha 2 R15 fru alpha 2 R14 fru alpha 2 CF FA2G 4808 bp C P(BLA) ALPHA D Xmn I (2299) uni Bam HI (430) Sma I (437) ampr puc bp rev Eco RI (451) P(LAC) ORI Abb. 2 A) Fruε Gen aus N.pelliculosa: Die Positionen von Introns, Exons, Primerbindungsstellen und eine Eco RI Erkennungssequenz sind angegeben. qpcr Primersind rot hervorgehoben. B) Fruα2 Gen aus C. fusiformis: Funktionelle Elemente sind wie unter A) beschrieben vermerkt. C) Plasmidkarte des puc18 Vektors. Funktionelle Elemente, Primerbindungsstellen (uni/rev) und relevante Restriktionsenzymschnittstellen sind angegeben. P(BLA), P(LAC) sind prokaryotische Promotoren. ALPHA bezeichnet den lacz ORF. ORI ist der Replikationsursprung. ampr, siehe Abb. 1. D) Beispielgel für die elektrophoretische Auftrennung von RNA aus C. fusiformis. Linke Spur, λ DNA-Eco130I Standard. Mittlere Spuren, 2 unabhängige RNA Präparationen. Rechte Spur, 100bp DNA Standard. 9

12 3.1 RT-PCR Analyse von CfWT und der Transformante Cfε und Klonierung des cdna Amplikons 1. RNA ist instabil und RNAsen überall 2. Pipettenspitzen und Eppendorfgefässe speziell für diesen Praktikumsteil mit Handschuhen stecken/verpacken und autoklavieren 3. DEPC behandelte Lösungen verwenden RNA Isolierung 1. je 250 ml ASW-Medium mit CfWT bzw. Cfε animpfen und bis zu Zelldichte von ca.10 6 Zellen/ml wachsen lassen 2. je 50 ml Kultur (5x 10 7 Zellen) in 50 ml Falcon Röhrchen abzentrifugieren (10 min / 2800g / RT) 3. Zellpellet in 1 ml ASW-Medium resuspendieren und in sterilem 1,5 ml Cup abzentrifugieren (2 min / g / RT), Überstand vollständig abnehmen 4. Zellpellet in 1 ml TRI REAGENT (enthält Guanidinisothiocyanate und Phenol) durch mehrmaliges auf- und abpipettieren gründlich resuspendieren 5. 5 min bei RT stehen lassen µl Chloroform zugeben und für 15 sec kräftig schütteln min bei RT stehen lassen, anschliessend abzentrifugieren (15 min / g / 4 C) 8. wässrige Phase (oben; nicht Interphase oder organ. Phase mitreißen!) in neues 1,5 ml Cup überführen, 500 µl Isopropanol zugeben und vore-texen; 9. 5 min bei RT stehen lassen, anschliessend zentrifugieren (10 min / g / 4 C) 10. Überstand vorsichtig abnehmen, Pellet mit 1 ml 70 % EtOH waschen (vore-texen) 11. zentrifugieren (10 min / g / 4 C), Überstand abnehmen, nochmals 1 min zentrifugieren, Überstand vollständig abnehmen 12. Cup mit geöffnetem Deckel bei RT 5-10 min trocknen (bis kein EtOH Geruch mehr spürbar; nicht zu lange trocknen!!!) 13. getrocknetes Pellet je in 20 µl H2O (DEPC-behandelt) aufnehmen, 10 min 65 C, anschliessend sofort aufs Eis stellen µl werden sofort zur Qualitätskontrolle mittels Gelelektrophorese analysiert [+ 5µl H2O (DEPC-behandelt), + 1 µl 6x DNA-Probenpuffer (frisch!); 1,5% Agarose] 15. falls RNA O.K., dann Aliquot (Assistenten fragen!) für RT-PCR entnehmen 16. restliche RNA-Lösung: +1/4 Vol. 10M LiCl (DEPC-behandelt), bei 4 C aufbewahren Reverse Transkription mit nachfolgender PCR (RT-PCR) jeweils für CfWT und Cfε x µl RNA-Präparation (Assistenten fragen!) + 1 µl RNase Inhibitor + 4 µl 5x First-Strand-Buffer (wird gestellt) + 1 µl 10 mm dntps (wird gestellt) + 1 µl 100 mm DTT (wird gestellt) + 2 µl 10 pmol/µl ON670 ad 19,5 µl H2O (DEPC-behandelt) + 0,5 µl 200 U/µl RevertAid RTase Schritt 1 Erststrangsynthese 50 min, 42 C 2 Inaktivierung 15 min, 70 C PCR-Ansatz jeweils für CfWT und Cfε (Mastermix für jeweils 4x 50 µl Ansätze) Ansätze: (i) cdna von CfWT (ii) cdna von Cfε (iii) Wasserkontrolle zusätzlich werden mit den Primerpaar X013/X008 vier unabhängige Reaktionen mit 1 µl pgfruε [GK14] 50 ng/µl (vom Assistenten gestellt) angesetzt: 10

13 die 4 Reaktionen dienen zur Herstellung der radioaktiven Sonde für die später beschriebene Southern Blot Analyse ε-frustulin-gen β-tubulin-gen RT-PCR Ansatz 2 µl RT-PCR Ansatz 2 µl 5x PCR Puffer 10 µl 5x PCR Puffer 10 µl 2 mm dntps 5 µl 2 mm dntps 5 µl 10 pmol/µl X013 2 µl 10 pmol/µl TUB18 2 µl 10 pmol/µl X008 2 µl 10 pmol/µl TUB28 2 µl H2O 28,5 µl H2O 28,5 µl Taq Pol. 0,5 µl Taq Pol. 0,5 µl Proben auf Eis halten, bis der Thermoblock der PCR Maschine 94 C erreicht hat Probengefässe in den Block setzen Schritt 1 Denaturierung 2 min, 94 C 2 Denaturierung 30 sec, 94 C 3 Annealing 30 sec, 58 C 4 Extension 45 sec, 72 C 5 Zyklen gehe 40x zurück zu 2 6 Extension 7 min, 72 C 7 Lagerung 4 C 1. 1/10 der PCR Reaktionen werden in einem 1% Agarosegel analysiert 2. erwartete Grösse der PCR-Produkte: o X013/X008: cdna 412 bp (genomische DNA: 661 bp) o TUB18/TUB28: cdna 868 bp (genomische DNA: 1327 bp!) Isolierung und Phosphorylierung des PCR-Produktes X013/X Ethanol-Fällung des PCR - Ansatzes (90 µl) 2. Pellet trocknen (37 C) 3. in 10 µl TE Puffer lösen, auf Eis zusammen pipettieren + 2 µl 10x T4-DNA-Pol Puffer + 1 µl 2 mm dntp - Mix + 5 U T4 DNA Polymerase + H 2 O ad 20 µl 12 C / 15 min, sofort auf Eis, inaktivieren: 70 C / 30 min 4. Elektrophorese in 1 % Agarosegel 5. Bande ausschneiden (nur 366nm UV-Lampe zur Detektion verwenden!) 6. mittels Qiaex II gel extraction kit (5 µl Glasmilch) eluieren 7. Elution mit 10 µl H 2 O + 1 µl 10x T4-PNK Puffer + 1 µl 10 mm ATP + 0,5 µl T4-Polynukleotidkinase ( 2U) 1 h / 37 C 10 min / 70 C µl des Ansatzes durch Elektrophorese in 1 % Agarose analysieren und Menge abschätzen. Rest bei -20 C aufbewaren bzw. für Ligation verwenden Isolierung von puc 18 und Vorbereiten für die Ligation (nach Birnboim und Doly) Plasmidpräparation im Midi-Maßstab ml ÜN-Kultur DH5a puc min 4000 U/min zentrifugieren, Überstand verwerfen 3. Pellet in 1,5 ml L I aufnehmen, 5 min auf Eis 4. 3 ml L II dazugeben, invertieren; nicht schütteln!!, 10 min auf Eis (nicht länger); Lösung sollte klar werden 5. 2,25 ml L III dazugeben, invertieren, 10 min auf Eis; weiße Flocken sollten ausfallen min bei 4 C zentrifugieren 11

14 7. Überstand mit 0,6 Volumen Isopropanol fällen; 10 min bei U/min und 4 C zentrifugieren 8. Überstand verwerfen, Pellet in 800 µl TE lösen 9. Zugabe von 800 µl 5 M LiCl, 10 min auf Eis min bei 4 C zentrifugieren, Überstand auf zwei Eppendorf-Reaktionsgefäße verteilen (2x 800 µl) 11. Fällung mit 2x 800 µl Isopropanol, waschen der Pellets mit 70 % Ethanol 12. Pellets in jeweils 250 µl TE aufnehmen, vereinigen (insgesamt jetzt 500 µl) 13. Zugabe von 2 µl RNase (10 µg/µl), Inkubation für 30 min bei 37 C 14. nacheinander mit je 1 Volumen Phenol, Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25/24/1), Chloroform/Isoamylalkohol (24/1) extrahieren 15. Zugabe von 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat ph 5,2, Fällung mit 1 Volumen Isopropanol, waschen mit 70 % Ethanol 16. Pellet in 100 µl TE oder Wasser aufnehmen 2,5 µl Plasmid-Lösung entnehmen +2,5 µl TE +1 µl 6x DNA-Probenpuffer (DNA-PP) Mengenabschätzung im 1% Agarosegel (1x TAE) Sma I-Verdau und Phosphatase-Behandlung von puc µg puc 18 werden mit 40 U SamI in NEB4 Puffer mit BSA (0.1 mg/ml) in einem Gesamtvolumen von 100 µl bei 25 C für 2h verdaut nach 1h werden 5 µl des SmaI Verdaus entnommen und mit 10 U XmnI in NEB4 Puffer mit BSA (0.1 mg/ml) in einem Gesamtvolumen von 20 µl bei 37 C für 1h verdaut 2. 5 µl des SmaI Verdaus und der gesamte SmaI/XmnI Verdau, sowie 250 ng unverdauter puc 18 werden in einem Agarosegel (1%) analysiert. 3. Restlicher SmaI Verdau: + 4 U CIP: 60 min / 37 C 4. Phenol/CHCl 3 -Extraktion 5. Ethanolfällung 6. Reinigung durch Elektrophorese in 1% Agarose (nur 366nm UV-Lampe zur Detektion verwenden!) Gelelution nach der Dialyseschlauch-Methode (vgl. Maniatis: mit 1x TAE bei 100 V) min genügen zur vollständigen Elution der DNA aus dem Gelstück 2. Zentrifugieren 3. Überstand Na-Acetat/Ethanolfällung 4. Pellet in 10 µl TE lösen Mengenabschätzung von 1/10 des Eluats mittels Agarose-Gelelektrophorese Ligation des PCR - Produktes mit puc18 und Transformation L1 L2 PCR - Produkt (blunt end, 5' phosphoryliert) 50 ng ---- puc 18 (Sma I, CIP) 100 ng 100 ng + 10x T4-DNA-Ligase-Puffer 1 µl 1 µl + 10 mm ATP 1 µl 1 µl + T4 DNA-Ligase 2 U 2 U + H2O ad 10 µl ad 10 µl RT, 4h oder ü.n. inkubieren Transformation (siehe 2.4) Ausstreichen der Transformationsansätze auf AXI-Platten Kolonie-PCR (Identifikation von Klonen, die das PCR-Produkt enthalten) 9 weisse Klone werden wie unter 2.5 beschrieben "gepickt", neu ausgestrichen, und mittels PCR analysiert. Eine Wasserkontrolle. 12

15 2x PCR-Mix (für elf 50 µl Reaktionen): 27,5 µl 2mM dntp-mix (wird gestellt) 110 µl 5x PCR Puffer (wird gestellt) 27,5 µl 10 pmol/µl uni primer 27,5 µl 10 pmol/µl rev primer 5,5 µl Taq Pol. 77 µl H2O PCR-Programm: Proben auf Eis halten, bis der Thermoblock der PCR Maschine 94 C erreicht hat Probengefässe in den Block setzen Schritt 1 Denaturierung 2 min, 94 C 2 Denaturierung 30 sec, 94 C 3 Annealing 30 sec, 55 C 4 Extension 45 sec, 72 C 5 Zyklen gehe 40x zurück zu 2 6 Extension 7 min, 72 C 7 Lagerung 4 C Je 10 µl der Ansätze auf 1% Agarose-Gel analysieren (erwartetes Produkt: ca. 500 bp) Plasmidpräparation und Restriktionsanalyse 1. von 2 in der Kolonie-PCR positiven Klonen wird jeweils das Plasmid aus 10 ml ü.n. Kultur angereichert (siehe 2.6) 2. jeweils 1 µg Plasmid- DNA werden mit 5U EcoRI und 5U BamHI in EcoRI Puffer mit BSA (0.1 mg/ml) in 20 µl Endvolumen bei 37 C für 1h vedaut und in einem Agarosegel (1%) analysiert 3.2 Sequenzierung des PCR-Produktes Sequenzierungsreaktion Denaturierung der Miniprep-DNA für die Sequenzierungsreaktion: ~ 5 µg DNA (aus Miniprep mit Phenol-/Chloroform-Extraktion und Isopropanolfällung) 4 µl 2 M NaOH ad 20 µl H 2 O 15 min, RT + 8 µl 5 M NH 4 -Acetat 100 µl Ethanol p. a. ( 20 C) 15 min, 20 C zentrifugieren, 10 min, 4 C, Eppendorfzentrifuge Pellet mit 70% Ethanol p. a. waschen, zentrifugieren, bei 37 C trocknen Annealing: Pellet + 1 µl 2 pmol / µl Primer 2 µl Annealing Puffer 10 µl H 2 O 15 min, 37 C (1) (1) 13

16 Polymerisation (T7-DNA-Polymerase): (2) + 2 µl Labelling Mix 2 µl 1,5 U (2) / µl T7-DNA-Polymerase (2) 1 µl 0,2 M DTT 1 µl α 35 (2) S-dATP 5 min, RT Je 2,5 µl Stop-Mixe [GATC] in Cups vorlegen, vorbereiten (2) Je 4,5 µl Reaktionsansatz dazu 5 min, 37 C (3) Je 5 µl Stop-Lösung dazu Bei 95 C aufschmelzen auf Eis, je 2 µl pro Spur auf das Sequeziergel auftragen. Bei -20 C aufbewahren (1) an die Wand pipettiert, mit dem H 2 O abgespült (2) an die Wand pipettiert, abzentrifugiert (3) in den Cup-Deckel pipettiert, abzentrifugiert Sequenziergel (6% Acrylamidgel) 33,6 g Harnstoff ultrapure ( 42 % m/v) 12 ml Acrylamid-Stammlösung 16 ml 5 TBE ad 80 ml H2O (25,8 ml) filtrieren über 0,2 µm Filter und entgasen (Wasserstrahlpumpe) Sockelgel: 10 ml Gel + 50 µl TEMED + 50 µl 25% Per Sequenziergel: 70 ml Gel + 70 µl TEMED + 70 µl 25% Per Apparatur [BioRad SequiGen] Glasplatte am Puffertank mit Repellsilan (Dichlor-dimethyl-silan in n-hexan) behandeln Puffer: 1 l 1 TBE Elektrophorese Vorlauf: ca. 30 min mit 60 Watt bis Temperatur 55 C erreicht Hauptlauf: 2 bis 2,5 h mit 50 Watt Gelaufarbeitung Gel auf Deckplatte 30 min in 2 l 10% Essigsäure techn. einlegen (Fixierung der DNA, herauslösen des Harnstoffs) auf Whatman-Papier abklatschen und mit Frischhaltefolie abdecken bei 80 C 1,5 h im Geltrockner trocknen Röntgenfilm ÜN. auflegen und entwickeln 3.3 Southern Blot mit restriktionsverdauter genomischer DNA von Cf WT und der Transformante Cfε Isolierung der genomischen DNA [Wizard Genomic DNA Purification Kit, Promega (siehe Anhang)] Algenaufschluß: 1. Ca. 500 ml CfWT bzw. Cfε (je max. 5x10 8 Zellen) aus Fermenter entnehmen (Fermenter wurde 5 Tage zuvor vorbereitet und angeimpft; Zelldichte sollte ca Zellen/ml betragen). Zellen abzentrifugieren (10 min 2000 g) und Pellet in wenig Überstand resuspendieren und in N2,fl. als Perlen einfrieren 2. unter N2,fl. im Mörser zerkleinern in 2-ml-Cup überführen (ca. 300 mg) ,2 ml Nucleic Lysis Solution (Art.-Nr. A7941) min/65 C im Wasserbad inkubieren, gelegentlich mischen 5. auf RT abkühlen, auf zwei 2-ml-Cups verteilen RNase Behandlung: 1. + je 1,5 µl 10 mg/ml RNase A (DNase-frei) min 37 C 14

17 Protein-Fällung: 1. + je 250 µl Protein Precipitation Solution (Art.-Nr. A7951), gut mischen min, 4 C bei höchster Umdrehungszahl zentrifugieren und Überstände abnehmen DNA-Fällung: 1. Überstände + je 700 µl Isopropanol (0,7 Vol.) 2. mischen, bis DNA sichtbar ausfällt 3. 1 min, RT bei höchster Umdrehungszahl zentrifugieren 4. Pellet mit je 600 µl 70% Ethanol waschen 5. 1 min, RT bei höchster Umdrehungszahl zentrifugieren 6. Pellet an Luft min trocken DNA lösen/analyse: 1. je 100 µl TE-Puffer zum Pellet geben 15 min/65 C im Wasserbad inkubieren; gelegentlich mischen 2. resuspendierte genomische DNA von CfWT bzw. Cfε vereinigen 3. 5 min, RT bei höchster Umdrehungszahl zentrifugieren Überstand: DNA-Lösung bei -20 C aufbewahren 4. 5 µl DNA-Lösung in 100 µl H 2 O verdünnen, Photometrische Bestimmung der DNA- Konzentration und des Verhältnisses E 260 /E 280 (30 bis 80 µg DNA, Ratio 260nm / 280nm > 1,7) ng auf Agarosegel überprüfen Verdau der genomischen DNA von CfWT und Cfε jeweils 2 Ansätze mit je 15 µg DNA o mit 30 U EcoRI in NEB EcoRI Puffer in einem Gesamtvolumen von 200 µl o mit 30 U BamHI in NEB BamHI Puffer in einem Gesamtvolumen von 200 µl o 4 h / 37 C inkubieren aus jedem Ansatz 10 µl entnehmen und auf 0,8 % Agarosegel kontrollieren falls Verdau funktioniert hat, dann Ethanol-Fällung (siehe 2.2.1) getrocknetes Pellet in 30 µl TE lösen Herstellen der 35 S-markierten Sonde PCR-Amplifikation eines fruε-genfragmentes (je Gruppe): PCR Reaktionen von 4 identischen Ansätzen mit dem Primerpaar X013/X008 und 1 µl pgfruε ( [GK14] 50 ng/µl) als Matrize (siehe 3.1.2) erwartete Grösse des PCR-Produktes: 671 bp 1. PCR-Ansätze vereinigen 2. Phenol/CHCl 3 -Extraktion 3. EtOH-Fällung 4. getrockneten Rückstand in 40 µl TE lösen und auf 4 Agarosegel-Taschen verteilen 5. PCR-Produkt Bande ( fruε -Genfragment) ausschneiden (nur 366nm UV-Lampe zur Detektion verwenden!) und mittels Qiaex (10 µl Glasmilch) eluieren (Mengenabschätzung von 1/10 des Eluats mittels Agarose-Gelelektrophorese ). Radioaktive Markierung ng fruε -Genfragment in 10 µl H2O µl Zufallshexamere (OD260/ml = 50) 3. 5 min / 95 C 4. 1 min / Eis µl 10x Klenow-DNA-Pol.-Puffer min / RT µl Mix aus dgtp,dctp,dttp (je 1 mm) µl 0.2 M DTT µl α[ 35 S]-dATP (> 1000 Ci/mmol) (= 20 µci) µl Klenow-DNA-Polymerase (1 U/µl) 15

18 11. 1h / 30 C µl datp (1 mm) min / 30 C min / 65 C µl STE µl in 5 ml Szinterlösung : Radioaktivitätsmessung 17. Reinigung über Sephadex G 50 Spin Column. Hettich Zentrifuge: 1500rpm, 2 min (gequollenes Gelmaterial in STE wird gestellt) 18. µl in 5 ml Szinterlösung : Radioaktivitätsmessung zur Bestimmung der Ausbeute Transfer der DNA auf eine Nylon-Membran und Hybridisierung in einem 0,8% Agarose-Gel werden folgende Proben aufgetragen: o jeweils 7.5 µg des konzentrierten Verdauansatz (siehe 3.3.2) in eine Tasche eines auftragen o 0,75 µg unverdaute genomische DNA als Referenz o 1 µg des DNA Standards o Positiv Kontrolle: 50 oder 150 attomol von EcoR I/ Nco I verdautem Plamid pble_fruε (ausgegeben vom Assistenten) Elektrophorese bei 5V/cm bis Bromphenolblau-Front 2/3 der Gellänge erreicht hat DNA-Transfer auf Membran nach Kapillar-Blot Vorschrift (abgewandelt nach Maniatis) Gel in ca. 3 Gelvolumen folgender Lösungen für die angegebenen Zeiten inkubieren: 1. 20min 0,25M HCl (frisch ansetzen) 2. 2x 15min 0,5M NaOH / 1,5M NaCl 3. 2x 15min 1M NH 4 Ac Transfer für mindestens 3-4h, ggf. über nacht (Transferlösung: 1M NH 4 Ac) Blotaufbau (schematisch): Transferlösung 0,5kg 3x Whatman-Papier Gel mit Parafilm abdichten Membran 2xWhatman-Papier Papierhandtücher, ca. 3cm hoch Fixierung der DNA durch UV-Quervernetzung mit Nylon-Membran ("Auto-crosslink"im Stratalinker von Stratagene =120 mj/cm 2 ). Prähybridisierung: 1. Membranen vorsichtig Rollen und in Hybridisierungsröhre überführen ml Hybridisierungspuffer (wird gestellt) zugeben 3. mindestens 1 h / 65 C im Hybridisierofen rollen 4. Hybridisierungspuffer verwerfen ml Hybridisierungspuffer zugeben Hybridisierung: 1. 5x 10 7 cpm der 35 S-markierte Sonde mit 120ul 10mg/ml Lachsspermien DNA versetzen 2. 5 min 95 C, sofort auf Eis stellen S-markierte Sonde zugeben 4. ü.n. / 65 C rollen Waschen der Membran: 1. alle Waschpuffer auf 65 o C vorgewärmen 2. radioaktiver Hybridisierungspuffer: rad. Abfall 3. Gefäß 1x mit 25 ml Waschpuffer 1 (3XSSC, 0.1% SDS) ausspülen: rad. Abfall 16

19 4. Membran 2x in je 25 ml Waschpuffer 2 (0.3XSSC, 0.1% SDS) 15 min / 65 o C rollen 5. Membran 2x in je 25 ml Waschpuffer 3 (0.1XSSC, 0.1% SDS)15 min / 65 o C rollen 6. Membran 2x in je 25 ml Waschpuffer 4 (0.1XSSC, 1.5% SDS)15 min / 65 o C rollen 7. Membran trocknen (RT) Autoradiographie: Radioaktivität auf der Membran wird mit Hilfe eines Phosphorimagersystems (LAS 1000) detektiert 3.4 Quantitative PCR mit genomischer DNA von CfWT und Cfε Quantitative PCR erlaubt es die Kopienzahl des in das C. fusiformis Genom integrierten Transgenes zu bestimmen. Hierzu wird ein Teilbereich des fruε-gens der Diatomee N. pelliculosa amplifiziert und die ursprüngliche Menge dieser Zielsequenz im Verhältnis zu der des fru-alpha-2 Gen aus C. fusiformis ermittelt. Aus Verdünnungsreihen des Plasmides pble_ FRUε und genomischer DNA aus WT Zellen wird die Effizienz der Amplifikation mit den Primerpaaren R16/17 und R14/15 bestimmt. Ausserdem wird die absolute Menge an integriertem fruε-gen unter Verwendung der pble_fruε Verdünnungsreihe errechnet. alle Pipetierarbeiten werden in VKL10.10 mit gestopften Spitzen durchgeführt: Mastermix, Sybr Green, HotStar Taq, Primer an qpcr Arbeitsplatz DNA-Proben am Platz je ein Student pro Gruppe pipettiert die Proben (genomische DNA im Triplikat, Wasserkontrolle) ein Student fertigt eine Verdünnungsreihe pble_fru ε an und inokkuliert mit dieser die qpcr Reaktion (im Duplikat, Wasserkontrolle) Verdünnungen von pble_fruε und genomischer DNA Eine Stocklösung von pble_fruε (0,48pM; linearisiert mit EcoRI) wird 1:20 in 10mM TRIS ph7,5 verdünnt (24fM). Von dieser Lösung wird eine 1:5 Verdünnungsserie in 10mM TRIS ph7,5 hergestellt, so dass man folgende Konzentrationen erhält: 4,8fM, 0,96fM, 0,19fM, 38aM. 1fM Lösungen genomischer DNA von WT und Transformante sollen hergestellt werden [Cf Genom ~ 95Mb; Durchschnittliches Molekulargewicht eines Basenpaares ~ 660] Ansätze für genomische DNA Proben von WT und Transformante (Primerpaare R14/15; R16/R17) Reaktionen 8 MM 9,67 77,36 HotStar Taq Qiagen 5u/ul 0,08 0,64 [1: ] SG Stock* 0,25 2 P#1 [10µM] 0,40 3,2 P#2 [10 µm] 0,40 3,2 Wasser 5,2 41,6 Gesamtvolumen die 16 µl werden in 0,1ml Reaktionsgefässen vorgelegt und mit 4 µl der genomischen DNA Verdünnung inokkuliert (Triplikate). (Nicht vergessen: Wasserkontrolle). im Ganzen werden je 6 Reaktionen für jede genomische DNA Probe (3x R14/15 Mix + 3x R16/17 Mix) und 2 Reaktionen für die Wasserkontrollen (1x R14/15 Mix + 1x R16/17 Mix) angesetzt. 17

20 3.4.3 Ansätze für pble_fruε und WT-genomische DNA Verdünnungsreihen (Primerpaare R16/R17 und R14/15) Reaktionen 12 MM 9,67 116,04 HotStar Taq Qiagen 5u/ul 0,08 0,96 [1: ] SG Stock* 0,25 3 P#1 [10µM] 0,40 4,8 P#2 [10 µm] 0,40 4,8 Wasser 5,2 62,4 Gesamtvolumen die 16 µl werden in 0.1ml Reaktionsgefässen vorgelegt und mit 4 µl der jeweiligen DNA Verdünnung inokkuliert (Duplikate). (Nicht vergessen: Wasserkontrolle) im Ganzen werden 11 Reaktionen (2x jede Probe der Verdünnungsreihe + 1x Wasserprobe) angesetzt Parameter für das RotorGene-3000 qpcr System von Corbett Research Cycle 95 c, 15 min 0 secs Cycling (40 repeats) Melt (60-95 c), hold 45 secs on the 1st step, hold 5 secs on next steps, Melt A(FAM/Sybr) Cycle Point Step 95 c, hold 15 secs Step 60 c, hold 60 secs, acquiring to Cycling A(FAM/Sybr) Datenauswertung Die Datenanalyse umfasst: absolute Quantifizierung (Absolute Quantitation) vergleichende Quantifizierung (Comparative Quantitation) Schmelzkurvenanalyse (Melting Curve) Kontrolle im Agarosegel von Proben mit identischer Schmelzkurve werden jeweils 5 µl einer qpcr Reaktion in einer 2%igen Agarosegelelektrophorese analysiert. Erwartete Amplikongrössen: R14/15: 188bp R16/17: 191bp 18

21 4 Anhang 4.1 Zusammensetzung der verwendeten Lösungen Herzustellende Lösungen (erster Praktikumstag) Für folgende Lösungen siehe Maniatis: TE (ph8.0; 50 ml, autoklavieren!) 3M NaAc ph5.2 (50 ml, autoklavieren!) 10xTAE (1 liter) STE (50 ml) 20x SSC (100 ml) 5x TBE (200ml) 2x YT-Medium (100 ml, autoklavieren!) LB-Medium (100 ml; autoklavieren!) SOB-Medium ohne MgCl 2 (100 ml, autoklavieren!) Herstellung von LB/Amp-Platten: LB Medium + 1,5 % Agar: 500 ml autoklavieren: 20 min auf ca 55 C abkühlen lassen +0,5 ml 100 mg/ml Ampicillin ca. 25 ml pro Platte gießen ( Sterilbank ) 30 min in der Sterilbank aushärten und trocknen lassen (Deckel halb offen) bei 4 C aufbewaren Herstellung von AXI-Platten: wie für LB/Amp-Platten beschrieben, mit: 40 µg/ml X-gal 0.5 mm IPTG ASW-Medium [1000 ml] Glycylglycin NaCl 1M CaCl 2 2M MgCl 2 2M MgSO 4 3M KCl 1M KNO 3 100mM Na 2 SiO xSE Lösung 1mg/ml Thiamin H 2 O ad 1l mit 1M NaOH ad ph 8.0 autoklavieren nach dem Abkühlen zusetzen: 2 ml 100 mm K 2 HPO mg 23,4 g 7,5 ml 10 ml 10 ml 2 ml 1,5 ml 2 ml 1 ml 0,5 ml 1000xSE Lösung [1000 ml] H 3 BO 3 1,14 g Na 2 EDTA 2H 2 O 6,05 g ZnCl mg CuCl 2 H 2 O 270 mg Na 2 MoO 4 2H 2 O 250 mg CoCl 2 6H 2 O 420 mg FeCl 2 4H 2 O 970 mg MnCl 2 4H 2 O 360 mg 19

22 1M Tris HCl ph 8,0 (50 ml) bei RT aufbewahren 0,5 M EDTA ph 8.0 (100 ml) bei RT aufbewahren H2O (50 ml, autoklavieren) bei RT aufbewahren 100 mg/ml Ampicillin (1ml, sterilfiltrieren) wird in Medien für Bakterienkulturen (LB/Amp oder 2xYT/Amp) 1:1000 verdünnt (Endkonz.: 100 µg/ml) bei 20 C aufbewahren 1M DTT (1 ml, sterilfiltrieren) 200 mm DTT Verdünnung herstellen beide bei 20 C aufbewahren 50 mm Tris 50 mm Glukose 15 mm EDTA 5 mg/ml Lysozym aus Hühnereiweiß ph 8,0 L I (25ml) 50 mm Tris 50 mm Glukose 15 mm EDTA 5 mg/ml Lysozym aus Hühnereiweiß ph 8,0 L II (25ml) 200 mm NaOH 1% SDS bei RT aufbewahren L III (25ml) 3M KAc mit HAc auf ph 4,8 einstellen (siehe Maniatis!) bei 4 C aufbewahren H-Puffer (1ml) 100 mm Tris HCl ph 7,5 66 mm MgCl2 600 mm NaCl bei 20 C aufbewahren Tfb I (50ml, sterilfiltrieren) 30 mm KAc 50 mm MnCl2 100 mm KCl 15 % Glycerin ph 5,8 mit HAc bei 4 C aufbewahren Tfb II (50ml, sterilfiltrieren) 10 mm Mops / NaOH ph 7,0 75mM CaCl2 10 mm KCl 15 % Glycerin bei 4 C aufbewahren 2,5 M CaCl 2 (1ml, sterilfiltrieren) bei RT aufbewahren 20

23 DNA-Lyse-Puffer (1ml) 2 M NaCl 0,1 M NaOH 0,5 % SDS bei RT aufbewahren 2 M MgCl 2 (10ml, autoklavieren) bei RT aufbewahren 1 M Glucose (1ml, sterilfiltrieren) bei RT aufbewahren 10 M LiCl (mit DEPC autoklaviert) Wasser (mit DEPC autoklaviert) 1M Ammonium Acetat 10% SDS Ausgegebene Lösungen: 10x NEB Puffer 100 mm Tris Ac ph 7,5 100 mm MgAc 500 mm KAc 5x PCR Puffer 250 mm Tris HCl ph 8,8 250 mm NaCl 12,5 mm MgCl 2 10 mm DTT 10x T4-PNK Puffer 500 mm Tris HCl ph 7,5 100 mm MgCl 2 50 mm DTT 10x T4-DNA-Polymerase Puffer 670 mm Tris HCl ph 8,8 67 mm MgCl mm β-mercaptoethanol 166 mm (NH 4 ) 2 SO 4 67 µm EDTA 1,6 µg/ml BSA 10x T4-DNA-Ligase Puffer 200 mm Tris HCl ph 7,5 50 mm MgCl 2 50 mm DTT 5x First-Strand Buffer 250 mm Tris HCl ph 8,3 375 mm KCl 15 mm MgCl 2 Fragmentierte Lachsspermien-DNA (10mg/ml) 6x DNA-Probenpuffer (für Agarose-Gele) 30% Glycerin 100 mm EDTA ph 8,0 0,125% Bromphenolblau 0,125% Xylencyanol 21

24 100 mm Spermidin, freie Base (1 ml, sterilfiltriert) bei RT aufbewahren 1M IPTG (sterilfiltriert) 20 mg/ml X-Gal (in DMF) Sequenzier-Lösungen: Annealing Puffer (1 ml) 280 µl 1 M Tris HCl ph 7,5 100 µl 1 M MgCl µl 1 M NaCl 270 µl H 2 O Labelling Mix (1 ml) µm dbtp 2 µl 100 mm dgtp * 2 µl 100 mm dttp 2 µl 100 mm dctp 994 µl H 2 O µl von µl H 2 O 3 µm je dbtp Stop-Lösung (1 ml) 980 µl deion. Formamid 20 µl 0,5 M EDTA ph 8,0 2 mg Bromphenolblau 2 mg Xylenxyanol Stop-Mixe [GATC] (je 1 ml) Puffer 400 µl 1 M Tris HCl ph 7,5 100 µl 1 M MgCl µl 1 M NaCl 2 Mix 6 µl 100 mm dgtp * 3 µl 100 mm datp 6 µl 100 mm dttp 6 µl 100 mm dctp 1979 µl H 2 O [G] 100 µl Puffer 500 µl 2 Mix 3 µl 5 mm ddgtp 397 µl H 2 O [A] 100 µl Puffer 500 µl 2 Mix 1,5 µl 5 mm ddatp 398,5 µl H 2 O [T] wie [G] jedoch ddttp [C] wie [G] jedoch ddctp 40% Acrylamid-Stammlösung 38 g Acrylamid 2 g Bis-Acrylamid ad 100 ml H 2 O, unter erwärmen auflösen, ÜN. mit 2% Mischbettionentauscher schütteln RT., über 0,2 µm Filter filtrieren, bei 4 C aufbewahren. 22

25 4.2 DNA Marker Log DNA Ladder ( kb) NEB, Katalog # N

26 4.3 DNA Sequenzen Sequenz von ppδblen 1 GC TTT CAT CGA TAG CAT TCA TAT TCG AGA TGA ATA TAG TGA AGC GAA CGA ATG CAG AAG CAT TCC ATT TCC CAC ACC CAA CGC GTT CGA CTG CAA CCC TAG GTG TAC ATT CAT TTG TAG TAA ACA CTC ACC GAT CAA ACA GAT CTT CTG CAT TAA CAT CGA CCA CGG CGC AGG CAA ACA TGT ACT AGC CTA TGA TGA TTG AAC AAA TAG CAA TAT AAC CAG ACA GCA CTG TTC TGT TGA CAT GAA TTA TAA GGG AAT AGC ACA CAA CTT CTT GCC ATC CCT GCC ACA TTA AGA GGA TTT CGA TCG GAA AAA TTT CAA TAC CGC AAA AGT CAC CTT AAA GAA ATC CAA ATC GTC TTG TCT GCA GAT GAC CCA TCC AAC CAA TTT GGG CGT TGC GGA GGC CAA CGG CGC TGT TTG CAA GCC GAC AGC GAT TGC TAC AGC AGT CAC TTG TTT TGC TTT CCA AGT TCT GAA GCC AAT ATA CGT GTT CCT GGA TGC TTT TGA GGC AAG TCG GAT GAT TCG CTG TTG TGT TTA GAT TAC TGC ATG GTG GTT TTG TTT GTC AGT GGT GAA ACG ATT CGT CTT ATT CCG CTG GAG TGA ATT TGC ATT GTG GCA CTG CGG CAG TAC CAT TTC AAA GCT GGA TAA CGT CTG TGA CTA GGG AAA TAT GAA AGA TAC TGT TGG TAA CGG TAA ATC AAC ATA TTA TAT CAA TTT AAC GGT GTT TAA ACG GTA TAA TGA CTT CAA CGG CTG TTA AAC GAC TAA TTA ATC TGT TTA ACG GCT GCG GTG AAT AAC GGT ATG TAC CTG TTC AAC TGA AGC TTC AAA CTA CAA TTA TAT CTT AAA AAA TGA GCG ATA ATC CGC GTA TTA CAG TTT GGT TGA GGA CAG CTT TTT GAG ATT CTC ATT TGC CTA CTA CAA GTC GTT CGC AAA M K Y T A ATC ATA AAA AAT CGG TCA CGT CAA TAT TGA ATG ATG AAG TAT ACA GCC K L T S A V P V L T A R D V A G AAG TTG ACC AGT GCC GTT CCG GTG CTC ACC GCG CGC GAC GTC GCC GGA A V E F W T D R L G F S R D F V GCG GTC GAG TTC TGG ACC GAC CGG CTC GGG TTC TCC CGG GAC TTC GTG E D D F A G V V R D D V T L F I GAG GAC GAC TTC GCC GGT GTG GTC CGG GAC GAC GTG ACC CTG TTC ATC S A V Q D Q V V P D N T L A W V AGC GCG GTC CAG GAC CAG GTG GTG CCG GAC AAC ACC CTG GCC TGG GTG W V R G L D E L Y A E W S E V V TGG GTG CGC GGC CTG GAC GAG CTG TAC GCC GAG TGG TCG GAG GTC GTG S T N F R D A S G P A M T E I G TCC ACG AAC TTC CGG GAC GCC TCC GGG CCG GCC ATG ACC GAG ATC GGC E Q P W G R E F A L R E P A G N GAG CAG CCG TGG GGG CGG GAG TTC GCC CTG CGC GAG CCG GCC GGC AAC C V H F V A E E Q D * TGC GTG CAC TTC GTG GCC GAG GAG CAG GAC TAA AGG CAG AGG TAT TTT TGT TGT TTC ATG CCA TGT TCT TGT ACC AGT TCA GTG CTT TTC TGA GAT AAG TCA CCA CAA GAA CAA CTC GAC TAC AGT TAG GGA GGA TTG ATA GAA TCG CTA TCG CCA TTC ATC GTC AAA AGT CCC AAT ATC TGA TTA AGT ATT AGT ACC ACT ATT CTA TCC ACT CTT GTC AGC ATT CTC TCT TGT TCC ATT CTA TGG CTT TCA TCG ATA GCA TTC ATA TTC GAG ATG AAT ATA GTG AAG CGA ACG AAT GCA GAA GCA TTC CAT TTC CCA CAC CCA ACG CGT TCG ACT

27 1632 GCA ACC CTA GGT GTA CAT TCA TTT GTA GTA AAC ACT CAC CGA TCA AAC AGA TCT TCT GCA TTA ACA TCG ACC ACG GCG CAG GCA AAC ATG TAC TAG CCT ATG ATG ATT GAA CAA ATA GCA ATA TAA CCA GAC AGC ACT GTT CTG TTG ACA TGA ATT ATA AGG GAA TAG CAC ACA ACT TCT TGC CAT CCC TGC CAC ATT AAG AGG ATT TCG ATC GGA AAA ATT TCA ATA CCG CAA AAG TCA CCT TAA AGA AAT CCA AAT CGT CTT GTC TGC AG Sequenz von fruε Exons und zugehörige Aminosäuresequenzen sind in Fettdruck dargestellt 'ATCATGAAGTCGCCGACCTCCCTCGTCGTCTCGGTCACTCTGGTCATTGCTGCCATTCTC I M K S P T S L V V S V T L V I A A I L S * S R R P P S S S R S L W S L L P F S H E V A D L P R R L G H S G H C C H S R GGCGCTGTAGGCCTCTATGCCAGCAAGACCAAAACTCTCTCGAATCTTCCAGCTCTTTCG G A V G L Y A S K T K T L S N L P A L S A L * A S M P A R P K L S R I F Q L F R R C R P L C Q Q D Q N S L E S S S S F D ACTAGTAACTCTTTGCGCCGTCAATTGCTTTCTCTGACCAGCAAGGGAAACAATGGCAGT T S N S L R R Q L L S L T S K G N N G S L V T L C A V N C F L * P A R E T M A V * * L F A P S I A F S D Q Q G K Q W Q S CCAGGTTCGGTCTTTCCGCTGGGAGAATGCCAAGGCGACTGCGACGGCGACACGGAATGT P G S V F P L G E C Q G D C D G D T E C Q V R S F R W E N A K A T A T A T R N V R F G L S A G R M P R R L R R R H G M C GCCAGCGGCCTCAAGTGCTTTCAACGATCGGGAACTGGTGAGTATCATCTTATGTTGTTG A S G L K C F Q R S G T G E Y H L M L L P A A S S A F N D R E L V S I I L C C C Q R P Q V L S T I G N W * V S S Y V V V TGGGCTGGTTTTGGAGCGTGAAACGTGAGGATACGCGTCGATAAATGGTCCATGGTCGGT W A G F G A * N V R I R V D K W S M V G G L V L E R E T * G Y A S I N G P W S V G W F W S V K R E D T R R * M V H G R S CGTCCGTCGTGGCTGTCACTCTGTCGCGCATCGCAACCCTTACTTACCCGACCCAAACAT R P S W L S L C R A S Q P L L T R P K H V R R G C H S V A H R N P Y L P D P N I S V V A V T L S R I A T L T Y P T Q T L TGAAACTCGCAGAATCTGTGCCTGGATGCTCTGGCTCTGGAAGCTCTGGAATTGATTATT * N S Q N L C L D A L A L E A L E L I I E T R R I C A W M L W L W K L W N * L L K L A E S V P G C S G S G S S G I D Y C GCTACAACCCAAACAATGGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGGGGCGGCGGCGGAAGCA A T T Q T M E A A A A A A A G A A A E A L Q P K Q W R R R R R R R R G R R R K Q Y N P N N G G G G G G G G G G G G G S S GCACTTCACTTACCATCAAGGGCGACAATGGCCGTCCCAGCAGCGCCTTTCCACTCGGTG A L H L P S R A T M A V P A A P F H S V H F T Y H Q G R Q W P S Q Q R L S T R * T S L T I K G D N G R P S S A F P L G E AATGCCAAGGAGACTGTGATTCAGACAATGAATGCCAGTCTGGTCTAAAGTGCTTTCAAC N A K E T V I Q T M N A S L V * S A F N M P R R L * F R Q * M P V W S K V L S T C Q G D C D S D N E C Q S G L K C F Q R 25

28 GAACTGGAACTCGTAAGTTGAAAACGGCGAGCATCCGGCGATCGTCGCGCTTGGTCGATC E L E L V S * K R R A S G D R R A W S I N W N S * V E N G E H P A I V A L G R S T G T R K L K T A S I R R S S R L V D R GACGGTTGGTCGGTCGTCGTGCCTGTCACTTGGCCATCTGTCATTCTGTCATGCACCGGA D G W S V V V P V T W P S V I L S C T G T V G R S S C L S L G H L S F C H A P E R L V G R R A C H L A I C H S V M H R N ACCTTACTAACCCCACACAACATTTCCGTTTTCAGAGCCTGTGCCTGGATGCTCTGGCTC T L L T P H N I S V F R A C A W M L W L P Y * P H T T F P F S (Q) P V P G C S G S L T N P T Q H F R F Q S L C L D A L A L TGGCACCAGTGGCAAGGACTACTGCTACAATCCCAACAATGGCGGAGGCGGCGGAGGTGA W H Q W Q G L L L Q S Q Q W R R R R R * G T S G K D Y C Y N P N N G G G G G G D A P V A R T T A T I P T M A E A A E V M TGGAGGCGGCGGTGGCGGCGCAGGCGGAGATGCCCTTCGTCTTTACTGGCAGGAAGGGTA W R R R W R R R R R C P S S L L A G R V G G G G G G A G G D A L R L Y W Q E G Y E A A V A A Q A E M P F V F T G R K G T CTTTTGGCAAGAAACGACGAGGGAGACCTTCTGGTGCATGAGGTAATTCGGCGGTGGTGT L L A R N D E G D L L V H E V I R R W C F W Q E T T R E T F W C M R * F G G G V F G K K R R G R P S G A * G N S A V V C GTGAGTCGATTCACCAATCTGTTGGTATTTAGTCTCACTCTTGACTGTCTTCGTTTTGGA V S R F T N L L V F S L T L D C L R F G * V D S P I C W Y L V S L L T V F V L D E S I H Q S V G I * S H S * L S S F W T CTGCAGATGCGACTCGTCGAGTCAAGAATGCGCTGAAGGTCGCGAGATTTACATTACAGA L Q M R L V E S R M R * R S R D L H Y R C R C D S S S Q E C A E G R E I Y I T D A D A T R R V K N A L K V A R F T L Q T CTGCCGAAAGGACATGTTGTCGGCTTGGACCTTTGTCAGCGCTGGTGACGGTGCCTACCT L P K G H V V G L D L C Q R W * R C L P C R K D M L S A W T F V S A G D G A Y L A E R T C C R L G P L S A L V T V P T S CATCAAGCTCAAGGCCAGTAACCTTTGCATGCGCGCTGGACGATGGATTACAATGGACAG H Q A Q G Q * P L H A R W T M D Y N G Q I K L K A S N L C M R A G R W I T M D S S S S R P V T F A C A L D D G L Q W T A CTGCGACTCGGGAGACCGCAACCAGCAGTTTAAAAGAGTTGGCAATAGCAACCGCTGGGA L R L G R P Q P A V * K S W Q * Q P L G C D S G D R N Q Q F K R V G N S N R W E A T R E T A T S S L K E L A I A T A G S GCTTCGACCCGTCATTGCATCAGGCTACTGCATCACTCAGTCTCATCATCCGCGACAAGG A S T R H C I R L L H H S V S S S A T R L R P V I A S G Y C I T Q S H H P R Q G F D P S L H Q A T A S L S L I I R D K A CGAGCGTCTTGGCTTGTGGGACTGCCGAATTCCCGAACGGGACACTACGAACTTCTGGGA R A S W L V G L P N S R T G H Y E L L G E R L G L W D C R I P E R D T T N F W E S V L A C G T A E F P N G T L R T S G S 1450 GTGGTGGTAA 3' V V V W W * G G 26