Zellbiologie und Physiologie Labormethoden der Biologie

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1 Zellbiologie und Physiologie Labormethoden der Biologie Molekularbiologie I Dr. Stefan Weinl > Molekularbiologie I Plasmidpräparation Transformation Restriktionsverdau Gel-Elektrophorese 1

2 > Experimenteller Ablauf Plasmidpräparation aus E. coli Zellen reines Plasmid Restriktionsverdau chemische Transformation des Plasmids in E. coli Zellen Agarose-Gelelektrophorese Selektion auf antibiotikahaltigen Platten > Experimenteller Ablauf Plasmidpräparation aus E. coli Zellen reines Plasmid Restriktionsverdau chemische Transformation des Plasmids in E. coli Zellen Agarose-Gelelektrophorese Selektion auf antibiotikahaltigen Platten 2

3 > Plasmid-Isolierung aus E. coli Zellen Experimentelle Vorgehensweise: > Aufschließen der Bakterienzellen > Isolierung der Plasmid-DNA > Reinigen der Plasmid-DNA > Aufnehmen in Wasser > Plasmid-Isolierung aus E. coli Zellen > Pelletieren der Bakterienzellen durch Zentrifugation > Vollständiges Resuspendieren im Lysispuffer(BIBDO 1) > Inkubation mit Denaturierungspuffer (BIBDO 2) > Fällung der Proteinereste(BIBDO 3) > Präzipitation der DNA durch Zugabe von 100% Ethanol > Reinigen der DNA mit 70% Ethanol > Trocknen der DNA und resuspendieren in Wasser 3

4 > Pelletieren der Bakterienzellen durch Zentrifugation > Plasmid-Isolierung aus E. coli Zellen > Pelletieren der Bakterienzellen durch Zentrifugation > Vollständiges Resuspendieren im Lysispuffer (BIBDO 1) > Inkubation mit Denaturierungspuffer (BIBDO 2) > Fällung der Proteinreste (BIBDO 3) > Präzipitation der DNA durch Zugabe von 100% Ethanol > Reinigen der DNA mit 70% Ethanol > Trocknen der DNA und resuspendieren in Wasser 4

5 > Isolierung der Plasmid-DNA BIBDO 1 BIBDO 1: EDTA, Glukose, Tris/HCl, Lysozym, RNase BIBDO2: NaOH, SDS BIBDO3: KAc, AcOH BIBDO 2 BIBDO 3 > Plasmid-Isolierung aus E. coli Zellen > Pelletieren der Bakterienzellen durch Zentrifugation > Vollständiges Resuspendieren im Lysispuffer (BIBDO 1) > Inkubation mit Denaturierungspuffer (BIBDO 2) > Fällung der Proteinereste (BIBDO 3) > Präzipitation der DNA durch Zugabe von 100% Ethanol > Reinigen der DNA mit 70% Ethanol > Trocknen der DNA und resuspendieren in Wasser 5

6 > Fällung und Reinigung der DNA Überstand überführen Zugabe 100% EtOH 2 x Zugabe 70% EtOH DNA-Pellet trocknen > Experimenteller Ablauf Plasmidpräparation aus E. coli Zellen reines Plasmid Restriktionsverdau chemische Transformation des Plasmids in E. coli Zellen Agarose-Gelelektrophorese Selektion auf antibiotikahaltigen Platten 6

7 > Klonierungsvector pks > Ampizillin Resistenz > origin of Replication > Lac-Promotor > LacZ-Genfragment mit MCS >f1 origin > Vektoren zur Klonierung pflanzlicher Gene Inserts: Gen1 Gen2 (600bp) (1200bp) 7

8 > Experimenteller Ablauf Plasmidpräparation aus E. coli Zellen reines Plasmid Restriktionsverdau chemische Transformation des Plasmids in E. coli Zellen Agarose-Gelelektrophorese Selektion auf antibiotikahaltigen Platten > Transformation der Plasmide in E.coli Zellen > Auftauen der kompetenten Zellen > Inkubation mit dem entsprechenden Plasmid > Hitzeschock bei 42 C im Wasserbad > Regeneration in Medium bei 37 C > Ausplattieren auf selektivem Medium 8

9 > Herstellung kompetenter E.coli Zellen > Transformation von E. coli Zellen mittels CaCl 2 Hitzeschock 9

10 > Transformation von E. coli Zellen mittels CaCl 2 > Selektion transformierter E. coli Zellen LacZ LacZ 10

11 > Blau-Weiss Selektion von Bakterien Vektor ohne Insert Vektor mit Insert > Das lacz-system: Funktion der ß-Galactosidase 11

12 > Das lacz-system: Regulation der ß-Galactosidase ohne Lactose > Das lacz-system: Regulation der ß-Galactosidase mit Lactose 12

13 > Das lacz-system: X-Gal X-Gal: 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-beta-D-Galactopyranosid > Das lacz-system: Regulation der ß-Galactosidase IPTG: Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid 13

14 > Das lacz-system: Regulation der ß-Galactosidase > lacz als Reportersystem 14

15 > lacz als Reportersystem pks Plasmid E. coli genome > das lacz-system: alpha-komplementation Bakteriengenom Plasmid 15

16 > Blau-Weiss Selektion von Bakterien Vektor ohne Insert Vektor mit Insert > Experimenteller Ablauf Plasmidpräparation aus E. coli Zellen reines Plasmid Restriktionsverdau chemische Transformation des Plasmids in E. coli Zellen Agarose-Gelelektrophorese Selektion auf antibiotikahaltigen Platten 16

17 > Restriktionsenzyme > Restriktion der isolierten Plasmide pks pks + Insert Restriktion mit BamH1 und EcoR1 Gelelektrophorese 3kb 3kb 1,2 kb 17

18 > Überprüfen des Restriktionsverdaus mittel Elektrophorese > Gießen eines Agarose-Gels > Vorbereiten und Laden der Proben > Gellauf > Visualisierung mittels UV-Licht > Dokumentation > Herstellen eines Agarosegeles D-Galactose und 3,6-Anhydro-L-galactose 18

19 > Prinzip der Elektrophorese > Prinzip der Elektrophorese 19

20 > Sichtbarmachen von DNA durch Ethidiumbromid 352nm 595nm > Sichtbarmachen von DNA durch HD green 352nm 595nm 20

21 > Dokumentation des Gels Gel Gelbild Geldokumentationssystem > Ergebnisauswertung 21

22 Reale Ergebnisauswertung > Technisches Alle Änderungen werden Ihnen entweder von Ihren Betreuern mitgeteilt oder werden im Kurssaal als aktualisierte Protokolle per Beamer zur Verfügung gestellt. BITTE DIESE ÄNDERUNGEN BEACHTEN UND IM PROTOKOLL BERÜCKSICHTIGEN! > Zum Transfer der Gelbilder USB-Stick mitbringen > Zur Dokumentation der Platten Digi-Cam oder Handy mitbringen 22

23 > Verhaltensregeln im S1-Labor (Personenschutz) > es ist ein Labor-Kittel zu tragen > es ist festes, geschlossenes Schuhwerk zu tragen (keine Sandalen oder Flip-Flops) > Es sind lange Hosen zu tragen (keine Short oder kurze Röcke) > es darf NICHT gegessen, getrunken, geraucht werden > auch beim Umgang mit HD green müssen Handschuhe getragen werden > Verhaltensregeln im S1-Labor (Sicherheitsmaßnahmen, Hygiene) > der Arbeitsplatz ist sauber zu halten > es muss vorsichtig pipettiert werden, um eine Kontamination der Umgebung (Pipette, Arbeitsplatz) zu vermeiden > alle gebrauchten Verbrauchsmaterialen (Eppis, Spitzen,..) müssen in den bereitgestellten Autoklavierbeuteln entsorgt werden 23

24 > Verhaltensregeln im S1-Labor (Sicherheitsmaßnahmen, Hygiene) > wird die Haut kontaminiert, muss sie desinfiziert werden > verschüttete Lösungen müssen mit Zellstoff aufgenommen sachgerecht entsorgt und der Platz mit 70% Ethanol desinfiziert werden > alle transgenen Organismen müssen nach Beendigung der Arbeiten sachgerecht durch Autoklavieren entsorgt werden > nach Beendigung der Arbeit müssen die Tische aufgeräumt und die Arbeitsflächen mit 70%igem Ethanol desinfiziert werden Viel Spaß 24