Grundlagen der Klonierung. Analytische Methoden der Biologie SS09 7 Klonierung und Gentechnik. Modul

Transkript

1 Restriktion und Ligation: Restriktion und Ligation: Grundlagen der Klonierung Modul

2 Restriktion und Ligation Verknüpfung von Fragmenten unterschiedlicher DNA Herkunft Restriktion und Ligation Die Ligationsreaktion 3 5 OH P P 5 HO 3 3 OH 5 OH Modul

3 Restriktion und Ligation Der Ligationsansatz 50 ng geschnittener, aufgereinigter Plasmidvektor 4 5 x (stöchiometrisch) Insert Ligasepuffer (mit ATP) Ligase mit Wasser auf 12 µl auffüllen Inkubation über Nacht bei 16 C DNA Moleküle können rekombiniert werden Klonierung von rekombinanter DNA Ausplattieren Modul

4 Restriktion und Ligation Die MCS des Plasmids puc18 in silico Planung von Klonierungen Modul

5 in silico Planung von Klonierungen in silico Planung von Klonierungen Modul

6 in silico Planung von Klonierungen Nukleinsäurehybridisierung Modul

7 Nukleinsäurehybridisierung Denaturierung und Renaturierung Nukleinsäurehybridisierung FISH: Fluorescent in situ Hybridization dient der chromosomalen Lokalisation von Sequenzabschnitten Verwendung fluoreszenzgekoppelter Markersonden leukaemie.de/sites/kompetenznetzleukaemie/content/e50/e3922/e5218/e10615/e11136/e11195/molzytabb1.gif Menschliche Metaphasechromosomen; Anfärbung spezifischer Regionen des Chromosomenpaars 22 Modul

8 Nukleinsäureblotting Kapillarblot Nukleinsäureblotting Zoo Blot (Fotografie von Dr. Marion Jurk) Modul

9 Nukleinsäureblotting Aufbau einer Slot und Dot Blotapparatur DNA Microarrays Prinzip der Hybridisierung liegt zugrunde gleichzeitige Untersuchung der Expression vieler Gene in einer Probe Modul

10 DNA Microarrays Aufbau eines Microarrays GAT AT ATTAACAG ATTAACAGGA ATTAACAG GGAT ATTAACAGGAA ATT TAACAGGAA ATTAACAGGAA ATTTACAGGAA ATTAACCGGAA ATTAACCGGAA ATTAACCGGAA A AA AA ATCTACAGGA ATCTACAGGA ATCTACAGGAA AT TCTACAGGAA ATCTACAGGAA ATTTACAGGAA ATTTACAGGAA ATTTACAGGAA AACGCCAG GGAA AACGCCAG GGAA TAACGCCAG GGAA AT TCTACGCCAGGAA AT TCTACGCCAGGAA AT TCTACGCCAGGAA 3 ATCTACCCAGGAA A ATCTACCCAGGA AA ATCTACCCAGGAA A 2 1 A B C DNA Microarrays Durchführung eines DNA Microarray Experiments Isolieren der mrna cdna Synthese Modul

11 Synthese von cdna cdna = copy DNA mrna Sequenz in Form von DNA keine Introns DNA Microarrays Durchführung eines DNA Microarray Experiments Microarray Isolieren der mrna Markierung der cdna mit Fluoreszenzfarbstoffen cdna Synthese Fluoreszierende cdna mit dem Microarray hybridisieren Modul

12 F532 Median Legend Unflagged Norm & Unflagged Good Norm & Good Bad Norm & Bad Absent Norm & Absent Not Found Norm & Not Found Selected Norm & Selected Analytische Methoden der Biologie SS09 DNA Microarrays Durchführung eines DNA Microarray Experiments Scannen Datenanalyse F635 Median DNA Microarrays Verschiedene Arten von Microarrays Modul

13 Mutagenese Mutagenese ortsgerichtete Mutagenese die zu mutagenisierende Sequenz muss bereits bekannt sein man sollte wissen, welche Mutation man einführen will es funktioniert am besten, Punktmutationen einzuführen, da man mit Primern arbeitet: Primer-Templat-Duplex 5'-cgatcccattggcgccaagcgctcctc-3' gaggctagggtaaccgaggttcgcgaggaggta Serin Alanin man untersucht also die Auswirkungen von einzelnen oder wenigen AS Austauschen Modul

14 Mutagenese ortsgerichtete Mutagenese Mutagenese Zufällige Mutagenese mittels mutagener Substanzen wird häufig verwendet, wenn man Gene finden will, die an einem bestimmten Prozess beteiligt sind Problem: Mutationen sind zufällig und deshalb müssen viele mutagenisierte Individuen untersucht werden Vorbereitung der Versuche teilweise aufwendig Substanzen, die für die Mutagenese eingesetzt werden, sind stark gesundheits schädlich h Modul

15 Mutagenese Zufällige Mutagenese mittels mutagener Substanzen Ethylmethansulfonat (EMS): Punktmutationen von G nach A oder C nach T +/+* x +/+ +/+* x +/+* Screening +*/+* Einbringen von DNA in Zellen: Einbringen von DNA in Zellen: Transformation und Transfektion Modul

16 Einbringen von DNA in Bakterien: Transformation Transformation chemisch kompetenter Zellen Plasmid DNA zu kompetenten Zellen geben 10 min auf Eis 1 min 42 C Hitzeschock Zugabe von Medium 1 h 37 C 37 C über Nacht Ausplattieren Einbringen von DNA in Bakterien: Transformation Transformation durch Elektroporation Stromquelle Deckel Küvette Elektroden elektrische Kontakte Zellsuspension Modul

17 Einbringen von DNA in eukaryotische Zellen: Transfektion chemische Reagenzien: DEAE Dextran DEAE Dextran: kationisches Polymer assoziiert mit negativ geladener DNA die positiven Ladungen erlauben der negativ geladenen Zellmembran zu kommen Aufnahme wahrscheinlich durch Endocytose Einbringen von DNA in eukaryotische Zellen: Transfektion chemische Reagenzien: Calciumphosphat Plasmid DNA Calciumchlorid Phosphat Puffer Calciumphosphat bildet mit DNA ein Präzipitat das Präzipitat wird von den Zellen über Endozytose oder Phagocytose aufgenommen Calciumphosphat hemmt möglicherweise Nukleasen 20 min 2 12 Std. Untersuchung Modul

18 Einbringen von DNA in eukaryotische Zellen: Transfektion chemische Reagenzien: Liposomenmethode Plasmidvektor-DNA Endozytose Endosom freigesetzte DNA Lipofection- Reagenz DNA-Lipid- Komplex Zellmembran Einbringen von DNA in eukaryotische Zellen: Transfektion physikalische Methoden: Elektroporation biolistische Methode mittels Genegun direkte Mikroinjektion Modul

19 Einbringen von DNA in eukaryotische Zellen: Transfektion Transiente und stabile Transfektion transiente Transfektion: Vektor wird nicht in das Wirtsgenom integriert, Transgen wird nur transient exprimiert stabile Transfektion: Transgen integriert ins Wirtsgenom; das ist selten und wird durch Cotransfektion mit einem Resistenzgen erreicht Einbringen von DNA in eukaryotische Zellen: Transfektion Mit einem GFP Vektor transfizierte S2 Zellen Modul

20 Einbringen von DNA in Organismen: Herstellung transgener Tiere Einbringen von DNA in Organismen Herstellung transgener Tiere am Beispiel von Drosophila Transposase Helferplasmid + P Element Vektor 5 Repeat 3 Repeat Duplikation der Insertionsstelle Transposition Transgen Marker Modul

21 Einbringen von DNA in Organismen Herstellung transgener Tiere am Beispiel von Drosophila Syncytium Polzellen- Knospung Helferplasmid und P-Element-Vektor mit white + -Markergen Zellularisierung x Einbringen von DNA in Organismen Herstellung transgener Tiere am Beispiel von Drosophila Modul

22 Einbringen von DNA in Organismen Herstellung transgener Tiere am Beispiel der Maus PCR Analyse oder Southern Blot der DNA knock out k und knock down Technikenk Modul

23 knock out und knock down Techniken knock out durch homologe Rekombination neo: vermittelt Neomycin Resistenz tk (Thymidinkinase): vermittelt Sensitivität gegenüber Ganciclovir knock out und knock down Techniken knock out durch homologe Rekombination Modul

24 knock out und knock down Techniken RNAi (RNA interference) knock out und knock down Techniken RNAi (RNA interference) l Modul