Transcriptomics: Analysis of Microarrays

Transkript

1 Transcriptomics: Analysis of Microarrays Dion Whitehead Division of Bioinformatics, Westfälische Wilhelms Universität Münster

2 Microarrays Vorlesungsüberblick : 1. Überblick von Microarray Technologie. 2. Wie Microarrays funktionieren (DNA und Oligonucleotide Microarrays. 3. Analyse der Ergebnisse.

3 Zur Auffrischung: Gen Transkription DNA > RNA > Proteine

4 Microarrays Überblick Expressionsanalyse mit Microarrays Bioinformatik: Auswertung des Vergleiches Vergleich der Expressionsstärke (z.b. Microarrays) Normalle Zellen Gen 3 als Target identifiziert mrna Gen 1 Gen 2 Gen 3 Bioinformatik: Herstellung der Microarrays anhand der Genomanalysen Bioinformatik: Homologiesuche (Datenbanken) Strukturanalyse Verwandschaften (Phylogenie) Potentielle Targets für Heilmittel gegen Krebs Krebszellen mrna

5 Microarrays Überblick Tausende von Gene können gleichzeitig gemessen werden. Neu Technologie (erst Artikel: 1995). Möglicher Fragen: Kanzerogene vs normale Zellen. Vergleich zwischen unterschiedlichen Wachstumsbedingungen z.b bei Hefe Zeitlicher Verlauf, z.b Reaktion der Pflanzen auf UV Stahlung Reaktion von menschlichen Zellen auf Behandlungen z.b durch Medikamente

6 Microarrays Überblick Zwei wichtigst Arten von Microarrays: DNA Microarrays (2 Farbe) Oligonucleotide Microarrays (von Affymetrix, 1 Farbe).

7 Microarrays DNA Microarrays Jede Gene von eine Genome ist "spotted" auf eine Glass oder Plastik scheibe.

8 Microarrays DNA Microarrays Die Zellen von zwei Gruppen: Kontrol und (hier als Beispiel) Zellen unter eine Stress e.g. osmotisch Stress. Extractieren RNA RNA ist mit einem Farbstoff gefärbt. Stress Kontrol

9 Microarrays DNA Microarrays Stress Gefärbt RNA über die Chip. Kontrol

10 Hybridisierung: Grundlegendes Prinzip basiert auf Southern Blot (50 Jahre alt). Bekannte Sequenzen einzelsträngig auf Microarray immobilisiert Gewebeprobe (mit unbekannter Konzentration an RNA) mit Fluoreszenz markiert Probe hybridisiert an Array Nicht hybridisierte Sequenzen werden durch Washschritt entfernt menge an hybridisierte RNA wird für jede Sequenz durch Fluoreszenz gemessen

11 Microarrays DNA Microarrays Waschen die ungebunden RNA weg. Die gefärbte RNA hybridisieren zum entsprechend Spots. Scannen für rot und dann grün.

12 Microarrays DNA Microarrays Stress Gelb Kreisen haben grün und rot RNA (Stress und Kontrol). Kontrol

13 Microarrays DNA Microarrays Echt Ergebnis eines Microarrys

14 Microarrays DNA Microarrays Gene Name Rot:Grün Verhältnis A B C D E F G F G... 1,2 0,1-3,2 2,3-0,5 8,3 2,5 8,3 2,5... Rot:grün Verhältnis ist die "relative Expression". z.b. 2,5 bedeutet Gene "G" Expression ist 2,5 mal höher in Stress (rot).

15 Microarrays DNA Microarrays DNA Microarrays: noch mal eine Überblick

16 Oligonucleotide Microarrays: grundlegendes Prinzip

17 Unterschiede cdna microarrays and oligonucleotide chips Klone pro Objektträger 2 Zustände pro Objektträger Oligonukleotide pro Objektträger 1 Zustand pro Objektträger günstig, <1000 Gene pro Objektträger = $25/träger Auswertung flexible Große Variation Kostspielig ($500 oder mehr). Kleine Anzahl an vorgefertigte Typen verfügbar, keine Chance spezialisierte Chips zu erhalten Vorgefertigte Chips ohne Aufwand zu haben

18 Großflächige Anwendung Biochemiker/Biologen/Genetiker können nur wenige Gene gleichzeitig charakterisieren Durch Genomsequenzierung Zugang zu kompletten Genomen Microarrays erlauben viele parallele Messungen in nur einem experimentellen Schritt

19 Microarrays Big picture: Wie funktionieren Prozesse in der Zelle? Zum Zeitpunkt X: Was macht Gen A/Proteine A mit Gen B/Protein B, Lokalisierung/Konzentration

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21 Ergebnisanalyse, Schritt 1: Normalisierung Normalisierung Minimalisierung systematischer Fehler cdna Microarrays (zwei Farben) zeigen Unterschiede in der Farbintensität zwischen Rot und Grün. Farbvertauschung in einem zweiten Schritt notwendig. Durch Normalisierung Vergleichbarkeit gewährleistet

22 Normalisierung eines einzelnen Arrays: Signalintensität vs. Verhältnis der gemessenen Signale zueinander Normalisierung mehrer Ergebnisse gleichzeitig

23 Ergebnisanalyse, Schritt 2: differenzielle Expression errechnen Differenzielle Expression ist eine unterschiedliche Expression von Genen der behandelten Gruppen im Vergleich zu der Kontrollgruppe Oft verwendet: ungefährer Expressionsunterschied zwischen der behandelten Gruppe und der Kontrollgruppe (z.b Gene X wird 4 mal so stark expremiert)

24 Ergebnisanalyse, Schritt 3...? In Abhängigkeit der Fragestellung, verschiedenste Datenanalysen möglich: Venn diagrams Clustering Pathway reconstruction Expression profiling Mehr...

25 Venn Diagram Überschneidung von Gene Gut erste Überblick

26 Clustering Zusammenfassung von Genen mit ähnlicher Expressionsrate (z.b zeitlich oder über mehrere Experimente hinweg) Sinnvoll bei zusammengefasste Experimente Grundsätzliche Annahme: Gene mit ähnlicher Expression über meherere Experimente hinweg sind möglicherweise an verwandte Prozessen beteiligt

27 Clustering

28 Pathway reconstruction befindet sich in der Entwicklung wahrscheinlicher unterschied in Expression RNA/Protein C. elegans functional gene network

29 Expression profiling Nicht alle Gene im einzeln bekannt, Expressionsrate nebensächlich Zusammenhang zwischen beschrieben Expessionsprofile und einem bekannten Krankheitsbild Diese Information für Diagnose und Behandlung nützlich

30 MapMan: Übersicht über Metabolismus

31 Grenzen des Verfahrens: wahrscheinlicher unterschied in Expression RNA/Protein (z.b durch post translationelle Regulation) Erste Schritt in der Erforschung von Genen oder Prozesse (liefert keine Beweise, eher testbare Hypothesen) Teuer! $20 $100K um genügend Daten für Veröffentlichung zu sammeln Praktische Probleme Unterscheidung zwischen Hintergrundrauschen und eigentlicher biologischer Aktivität schwierig. Wiederholung der Experimente oft notwendig aber aufgrund von Aufwand/Kosten nicht durchführbar. Feine Unterschiede in der Expression oft nicht wahrnehmbar (Variation aufgrund unbekannter biologischer Zusammenhänge oder aufgrund von veränderten Bedingungen)

32 ENDE