Versuch 2 DNA Reparatur und Rekombination
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- Ewald Weiss
- vor 6 Jahren
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1 Versuch 2 DNA Reparatur und Rekombination
2 Warum ist DNA-Reparatur wichtig? Genetische Variation ist doch der Motor der Evolution. Mutationen durch Externe Einflüsse: Ionisierende Strahlung Chemotherapeutika mutagene Substanzen Aber auch physiologisch: Spontan bei der DNA-Replikation Meiose durch Sauerstoffradikale - Eine von 1000 ausgetauschten Basen bleibt als permante Mutation - Sehr effizientes DNA-Reparatursystem - besondere Eignung des DNA Doppelstranges Patientin mit Werner-Syndrom (Progeria)
3 DNA-Schäden, die die DNA-Sequenz schnell verändern Desaminierung von Cytosin Pyrimidindimere z.b. Thymindimere durch UV-Strahlung Folgen: Bei der DNA-Replikation kommt es zur Substitution einer Base
4 Zwei Pathways für die Nukleotid Entfernungs Reparatur (NER) Basen-Exzisionsreparatur Nukleotid-Exzisionsreparatur
5 Reparatur von Doppelstrangbrüchen Exonuclease, überhängende 3 Enden Heteroduplexmolekül Überhängende Enden finden homologe Region des 2. Chromosomes Synthese Lösen vom Template
6 Reparatur von Doppelstrangbrüchen Exonuclease, überhängende 3 Enden Heteroduplexmolekül Überhängende Enden finden homologe Region des 2. Chromosomes Wie wird dieser Vorgang vermittelt? Synthese Lösen vom Template
7 Rad51 ermöglicht DNA-Einzelsträngen die Paarung mit einem homologen Bereich einer DNA-Doppelhelix Spo11 initiert Dopplestrangbruch DSB rekrutiert MRX Komplex Mre11 Nuklease Komplex - MRX: Mre11 Rad50 Xrs2 End trimming Strangaustausch durch Rad51 und Dcm1 Aktivität
8 Transformation oder Transfektion? Beides meint die nicht-virale Übertragung von freier DNA in Zellen Transformation: Übertragung in Bakterien, Pilze, Algen, Hefen Pflanzen Transfektion: Übertragung in eukaryotische Tier- und Menschenzellen Verschiedene Methoden der Hefetransformation Spheroplast Methode Lithiumacetat Methode Elektroporation Verdau der Zellwand + PEG + LiAc Hefezellen DNA + PEG + CaCl 2 42 C
9 Hefetransformation - PEG (Polyethylenglycol) ist essentiell - Lithiumacetat, Hitzeschock 42 C und Zellen in exponentieller Wachstumsphase verbessern die Effizienz - Funktion der Carrier oder ssdna bisher unklar PEG vermittelt die Bindung der DNA an die ZW (gelöste DNA gelangt nicht in die Zelle) DNA gelangt über Endozytose in die Zelle LiAc und Hitzeschock helfen der DNA durch die ZW DNA gelangt über Endozytose in die Zelle LiAc und Hitzeschock helfen der DNA durch die ZW S.Kawai et al.,2010
10 Plasmide in Hefe Centromer Vektor Chromosome 3 von S. cerevisiae CEN Centromer ARS - autonom replizierende Sequenz ori - Origin of Replication MCS Multiple cloning site C. Yang, J. F. Theis and C. S. Newlon, 1999
11 Plasmide in Hefe Centromer Vektor Episomaler Vektor Integrierender Vektor Keine Integration ins Genom autonome Replikation in Hefe Hohe Stabilität durch Centromer Sequenz Kopienzahl 1 Keine Integration ins Genom autonome Replikation in Hefe Geringe Stabilität unter nicht selektiven Bedingungen Hohe Kopienzahl (3-10) Integration ins Genom Keine autonome Replikation in Hefe Durch Integration hohe Stabilität
12 Centromer Vektor Episomaler Vektor Integrierender Vektor Nicht genom. integriert linearisiert; genomisch integriert CEN ARS ARS Transformation
13 YAC - Yeast Artificial Chromosome Lineare DNA, da Telomer-Sequenzen Autonom replizierend (ARS) Kopienzahl 1 Hohe mitotische und meiotische Stabilität Sehr große DNA-Stücke können insertiert werden (ca kB)
14 Transformation von Hefe Centromer Vektor (prs316) Integrierender Vektor (prs306 GAL1placZ) Integrativer Vektor URA3-Marker prs306 GAL1placZ GAL1p lacz Restriktion mit AgeI 5'-A^C C G G T-3'! 3'-T G G C C^A-5'! URA3-Marker prs306 GAL1placZ lacz AgeI GAL1p GAL1 genomische DNA GAL1p GAL1 Anlagerung URA3-Marker prs306 GAL1placZ lacz GAL1 genom. DNA nach der Integration Homologe Rekombination GAL1p lacz URA3-Marker GAL1p GAL1 Plasmid Sequenz
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