Die Stille der Transkription. Mating-type switching in der Bäckerhefe. Heterochromatin in Drosophila (Entdeckung der Histon-Methyltransferasen)

Transkript

1 Die Stille der Transkription Mating-type switching in der Bäckerhefe Heterochromatin in Drosophila (Entdeckung der Histon-Methyltransferasen) 85

2 Kondensation größerer Chromatinbereiche zb. am Telomer 86

3 Silencing und Mating type switching in der Hefe: haploid: MATa oder MATα MATa diploid: MATa / MATα nur die Mutterzelle wechselt den Paarungstyp MATa MATa Tochterzelle MATα heterothallische Mutanten wechseln den Paarungstyp nicht: homothallische Hefe: HO + heterothallische Hefe: ho - MATα MATα Fragen: Wie wird der Paarungstyp determiniert? Was ist die Ursache für das mating-type switching 87

4 Der Paarungstyp wird durch den Mating typ locus (MAT) determiniert: MAT a MAT α mat a1 mat α2 mat α1 MAT a haploide Zelle MAT α haploide Zelle MATa /MATα Diploide Zellen: MAT α mat a1 mat α2 mat α1

5 Kombinatorische Kontrolle durch Kombination verschiedener Tx- Faktoren Quelle: Watson ed6 89

6 Was ist die Ursache für das mating-type switching? Es gibt drei Mating type Kassetten (HML und HMR werden aber nicht exprimiert) HMLα MAT a HMRa HO Degradation der MATa Information und Reparatur mit HMLα als Matrize MATa switching zu MATα HO-Endonuklease schneidet eine spezifische Sequenz im MAT-Locus: dieseser Doppelstrangbruch führt zur Genkonversion 90

7 Warum werden die stillen MAT-loci nicht exprimiert? Die Entdeckung von Silencern* HMLα MAT a HMRa mat α1 mat α2 mat a1 mat a1 Sequenzen in den stillen MAT -loci führen zur Ausbildung von Heterochromatin in HML und HMR: Silencer nur mata1 wird exprimiert wie wirken Silencer? Isolierung von Mutanten, die kein Silencing machen SIR1, SIR 2 (Histondeacetylase), SIR3, SIR4,...(solche Mutanten werden steril) Silencer*: nicht zu verwechseln mit gene silencing durch sirnas 91

8 Die Wirkung von Sir Proteinen: 1.DNA bindende Proteine (Rap1, Abf1, ORC) erkennen Sequenzen in HML-loci 2.Rekrutierung von Sir1, Sir2, Sir3, Sir4 2.Sir3 /Sir 4 wechselwiken mit Histonen H3 und H4 (deacetyliert) 3. Sir2 ist eine Histondeacetylase, Ermöglicht mehr Bindung von Sir3/Sir4 4. Ausdehnung des heterochromatischen Bereichs durch Polymerisation von Sir3/Sir4 Die Sir-Proteine waren der Ausgangspunkt zur Molekularen Analyse von Heterochromatin 92

9 Andere heterochromatische Bereiche in der Hefe Telomere ribosomale DNA Repeats (rdna) Centromere SIR2 ist die zentrale Histondeacetylase in Heterochromatin Sir2 deacetyliert Histon H4K16. Sir3 und Sir4/Sir2 Komplex binden an deacetyliertes H4K16 So breitet sich das Hetrerochromatin aus. Sir2 im Kopmlex mit Sir3 und Sir4 zusätzliche Substrate in H3 und H4 werden erkannt. In angrenzenden euchromatischen Bereichen ist die Sas Acetyltransferase aktiv (something about silencing) Histon wird an der selben Stelle acetyliert (H4K16) 93

10 Silencing ist nicht immer stabil Ein Reporter-System zur Analyse des Silencing in der Hefe Die Ausdehnung heterochromatischer Bereiche variiert PEV: (Position effect variegation) Erklärung: Die Ausdehnung heterochromatischer Bereiche kann variieren 94

11 Position Effect variegation in Drosophila und Silencing in der Spalthefe S. pombe: Identifizierung von Histon-Methyltransferasen als wichtige Regulatoren von Heterochromatin Genetik: Su(var)3-9: Suppressor of variegation Dann lange nichts Dann die Entdeckung, dass Su(var)3-9 und homologe Proteine Ähnlichkeit zu Methyltransferasen haben (Die SET-Domäne) Histon H3-Lys9 Su(var)3-9 H3-Lys9-Met Heterochromatin Protein HP1 (Chromodomain Protein) Repression 95

12 S. pombe Silencing: Ähnlich zum Mechanismus in Drosophila S. pombe Swi6 ist das Ortholog des Drosophila Heterochromatinproteins HP1 K9 Methylierung verhindert die für Euchromatin typische K14 Acetylierung 96

13 Auswirkungen von Heterochromatin 97

14 Ein klassisches Beispiel von Heterochromatin: Das inaktive X- Chromosom (Der Barr Körper) Heterochromatin: typische Eigenschaften von Heterochromatin: Hypermethylierte DNA, wenig acetylierte Core Histone H3/H4 späte Replikation während der S-Phase 98

15 Die Inaktivierung eines der X- Chromosomen bei Frauen Warum? Dosis Kompensation i.e die Expression X-chromosmaler Gene muss in männlichen Zellen und in weiblichen Zellen gleich sein Welches Chromosom? Mensch et al. : zufällig im Zellstadium Ein spezieller Locus auf dem X-Chromosom ist für die Inaktivierung verantwortlich: X-inactivation center 99

16 XIC: "X-inactivation center" auf dem X-Chromosom Xist Dsxpas34-Marker Tsix Xist: X-inactive transcript 17 kb RNA Xce Xce: X-controlling element Tsix: anti-sense transcript zu Xist Xist : Expression vom inaktiven X (Xi) als einziges Gen keine Expression vom aktiven X Xist RNA bindet entlang des gesamten inaktiven X-Chromosom Tsix wirk antagonistisch zu Xist: Modell: Ausbildung eines Tsix/Xist Duplexes am aktiven X 100

17 Die Xist RNA dekoriert das gesamte inaktive X-Chromosom Nachweis der Xist RNA durch Hybridisierung in Metaphasezellen Das inaktive X hat weniger Acetylierte Histone (hier Nachweis von Acetyliertem H4) 101

18 Aufrechterhaltung der Inaktivierung Das gängige Model: Xist RNA rekrutiert spezifische Heterochromatinproteine: Polycomp repressor complex1 und 2 (PRC1 und PRC2) Histon H2A K119 Ubiquitinierung PRC2: Histon H3 K27 Trimethylierung. Histon H4 K20 Methylierung später akkumulieren Histonvarianten macrohsa und man findet deacetyliertes Histon H4 noch später wird auch die DNA an Cytosin methyliert 102

19 Andere Funktionen von Histonen bzw. Chromatinstruktur: Reparatur und Rekombination 103

20 Wie erfolgt eigentlich die Verarbeitung der Dopplestrangbrüche beim Mating type Switching? HMLα MAT a HMRa HO Degradation der MATa Information und Reparatur mit HMLα als Matrize homologe Rekombination (Genkonversion) wird eingeleitet. Der Begriff Genkonversion stammt aus der Beobachtung, dass dabei ein Allel in ein anderes konvertiert wird. In der klassischen Pilzgenetik beobachtete man seltene 1:3 Segregation von Allelen (R. Holliday 1964). 104

21 105

22 A) Bei der Meisoe erfolgt der Doppelstrangbruch (DSB) programmiert durch Ezyme wie Spo11 (Hefe). B) Beim switching durch die HO Endonuklease C) In somatischen Zelle durch DNA Schäden Das Switching ist mechanistisch identisch mit der Reparatur von Doppestrangbrüchen nach oder während der S-Phase wenn Schwesterchromatide zur Verfügung stehen: 106

23 DER DOPPELSTRANGBRUCH rekrutiert MRX Komplex Mre11 Nuklease Komplex MRX: Mre11 Nuklease Rad 50 Xrs2 Strangaustausch mit reca homologen Rad51 Dcm1 In diesen Komplexen findet man in Vertebraten auch BCRCA2 BRCA2 (Defekt führt zu Prädisposition für Krebs, ( breast cancer ) 107

24 Das passiert nach Bestrahlung sehr schnell: Eine Kultur von Fibroblasten wurde in Streifen mit Röntgenstrahlen bestrahlt. nach 30 Minuten findet man neu synthetisierte DNA (hellgrün (Einbau von Brom-desoxyUridin (BrdU); Nachweis mit Fluoreszierendem Antikörper gegen BrdU) Bereiche neusynthetisierter DNA enthalten Mre11 Protein. 108

25 Auch hierbei ist die Struktur der Nukleosomen wichtig: 109

26 Bestrahlung von Blutzellen führt zur H2AX Phosphorylieung (gamma γ-h2ax) und Akkumulation dieser Histonvariante am Doppelstrangbruch Proteinkinasen werden aktiv (Stopp des Zellzyklus) Mec1/Tel1 (ATM) DNA-PK Histon H2AX Variante wird phosphoryliert. Akkumulation von Reparaturenzymen in sehr kurzer Zeit direkt am Doppelstrangbruch. grün: γ-h2ax Foci nach Bestrahlung detaillierte Analyse in Hefe: Cohesinproteine, Mre11 und Histon H2AX akkumulieren alle bekannte der letzten Stunden 110

27 Was passiert wenn kein homologer Partner da ist? Wenn der DSB nach der Replikation stattfindet, ist das Schwesterchromatid da und es wird über homologe Rekombination repariert Und wenn es vor der Repliation stattfindet? (HO wird kurz vor der Replikation aktiv)? Dann kann der Doppelstrangbruch wieder auf gut Glück ligiert werden HMLα MAT a HMRa HMLα MAT a HO HMRa Dieser Prozess heißt nonhomologous end joining oder : NHEJ Dieser Weg ist in Tieren sehr aktv und wir auch für die Rekombination von Antikörgergenen eingesetzt. 111

28 Man nehme: Hefezellen, die keine Möglichkeit haben durch homologe Rekombination den HO Doppelstrangbruch zu reparieren. Man induziere die Expression von HO Nuklease Analysiere die Überlebenden Solche Testsysteme wurden verwendet, um diese Prozesse genetisch zu studieren. 112

29 Die Enzyme des NHEJ Hier entstehen Fehler durch den Verlust bzw. Addition von Nukleotiden (Mutationen) Schätzungen: 2000 Veränderungen/ somatische Zelle am Ende unseres Lebens Ku70/89 bilden einen Ring um die DNA 113

30 (Alberts Kapitel 5) 114

31 Die Take home lesson: kovalente Modifikationen von Chromatinproteinen hat funktionelle Bedeutung für alle Prozesse der Genexpression und DNA Modifikationen (Rekombination). 115

32 Zusammenfassung Stunde 5/6 Die Bedeutung der Chromatinstruktur für die Ausbildung von Heterochromatin Histondeacetylasen modifizieren Chromatin am Telomer Silencing von mating type Genen in der Hefe Einige Gene deren Produkte für die Ausbildung von Heterochromatin in Drosophila kodieren für Histon-Methyltransferasen. Chromatin Protein HP1 erkennt und bindet Methylierte Histone. Histonmethylierung am inatktiven X-Chromosom. Reparatur und Rekombination Rekrutierung von Repataturenzymen und Histonvarianten am Doppelstrangbruch Die Enzyme des NHEJ, nonhomologous end joining 116

33 Übungsfragen und notwendiges zur Klausur. Fragen kommen aus den Zusammenfassungen und aus dem Folgenden: Wie sieht ein Nukleosom aus? Welche Biochemischen Reaktionen führen zu: Acetylierung, Methylierung, Ubiquitinierung? 117