Wechselwirkung verschiedener Reparaturwege bei der Prozessierung von DNA Strahlenschäden

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1 02NUK Projektleitung: G. Taucher-Scholz Wechselwirkung verschiedener Reparaturwege bei der Prozessierung von DNA Strahlenschäden Projektstatusgespräch Nukleare Sicherheitsforschung KIT März 2013

2 Motivation: Das Ergebnis der DNA Reparatur bestimmt die Folgen einer Bestrahlung korrekt repariert Zelle Ionisierende Strahlung Zelle mit DNA-Schaden falsch repariert Überleben Schwerwiegendste DNA Schädigung: Doppelstrangbruch (DSB) nicht repariert Mutation Chromosomen- Schäden unkontrollierte Zellteilung Zelltod Krebsinduktion

3 02NUK001A-C/E M. Löbrich TU Darmstadt Zellzyklus Kinetik der Reparaturwege G. Taucher-Scholz GSI Biophysik, Darmstadt Schadenskomplexität Schwerionenstrahl Reparatur DNA Verbundprojekte Schwerpunkte G. Iliakis Universität Essen Backup-Reparaturwege J. Dahm-Daphi Universität Hamburg Struktur der Doppelstrangbrüche Reporter Assay Doppelstrangbrüche. H. Zitzelsberger HMGU München Definierte Mutanten in DT40

4 Beitrag zum Kompetenzerhalt Ausbildung: 9 Doktoranden in Strahlenbiologie promoviert Postdocs Master- und Bachelorarbeiten spezielle Techniken: Mikrostrahlen, Laserquelle, dichtionisierende Strahlung Lehre: - Graduiertenkollegs : Vorträge / Soft Skill Kurse - Schwerpunkt Strahlenbiologie TUD Master (neue Lehrstühle); Verleihung Professur GSI - Vorlesungen / Module Vernetzung: HGF + Unis: Darmstadt, Essen, Hamburg internationale Vernetzung /ESA radiation lab. GSI -Treffen: Vorträge und intensiver Informationsaustausch - gemeinsame Publikationen - Austausch von Zellen/ Materialen/ Methoden - Zugang zu verschiedenen Bestrahlungsmodalitäten Schwerionen GSI

5 Wissenschaftliche Erfolge Tagungen: - Beiträge zu nationalen und internationalen Tagungen, Vorträge - Ausrichtung GBS in Essen (2009), Hamburg (2010) und Darmstadt (2013) - Doktoranden: Posterpreise / Reisestipendien /Auswahl NASA Summer School / Teilnahme Nobelpreisträgertreffen Folgeprojekte: Förderung gemeinsamer Projekte/ESA radiation lab Veröffentlichungen: - über 20 Publikationen in renommierten ( peer reviewed ) Fachzeitschriften + zusätzliche under revision auch gemeinsame Co-Authorenschaft

6 Reparatur von DNA Doppelstrangbrüchen (DSB) Frühe Schadensantwort Wichtigste Reparaturwege Nicht Homologes End Joining NHEJ HR Homologe Rekombination DSB Histon H2AX mod. Kinner al al., NAR 2008 H2AX/DNA schnell teils ungenau Foci DSB Zellkerne humaner Bindegewebszellen. Immunfärbung 30 min nach 0.5 Gy Röntgen (B. Meyer, GSI) Chromatiden DSB DNA-Stränge G2-Phase des Zellzyklus Auswahl des Reparaturweges? korrekt / fehlerbehaftet? Korrekt (Kopie der verdoppelten DNA) in G2

7 Alternative Backup Mechanismen der DSB Reparatur NHEJ von strahleninduzierten DSBs Schnelle Komponente (10-30 min) ohne DNA-PK Langsame Komponente (2-20 h) Mutanten der verschiedenen Ligasen in unterschiedlichen Kombinationen Ligase III Schlüsselprotein D-NHEJ? B-NHEJ - Backup NHEJ - ersetzt Ligase I (DNA Replikation) Arakawa H, et al., Nucl. Acids Res. (2012) - Funktion in HR? Paul K, et al. (2013) (MS under revision)

8 Zellüberleben: Rolle von Ligase III Ligase III: Beteiligung an B-NHEJ Reparatur im Zellüberleben bestätigt Uni HMGU Paul K, et al. &(2013) (MS under revision). Komplexe Schäden: Ligase III kann Verknüpfung übernehmen Teilchen Wildtyp LIG1 -/- LIG4 -/- nur LIG III X-ray Teilchen X-ray kein Einfluss auf Überleben nach Ionenbestrahlung wenn nur Ligase III vorhanden ist Singh et al. BMC Radiat. Oncol. (2013) MS under revision

9 Hauptwege der Reparatur von Strahlenschäden (DSB) DNA-PK Die meisten DSB werden schnell über NHEJ in allen Zellzyklusphasen G2 BRCA2 HR Vortrag Ch. Reul Ein Teil der DSB wird langsam repariert und benötigt ATM UKE Köcher S, et al. Nucl. Acids. Res. (2012) Reporter: ATM/ Artemis in HR/G2 ATM bei Replikation Beucher et al. EMBO J. (2009) Jeggo et al., Radiother. Oncol. (2011)

10 Chromatinstruktur beeinflusst die DSB Reparatur Chemikalien Euchr. (EC) HC X-rays X-rays mcb.illinois.edu/faculty/profile/cmizzen Euchromatin: aktive Gene, DNA Sequenzen einmalig vorhanden aufgelockert Heterochromatin: inaktive Gene, sich wiederholende (repetitive) DNA Sequenzen stark kompaktiert: geschlossene Struktur radonc.wustl.edu/.../researchprograms.aspx Schnelle Reparatur NHEJ Langsame Reparatur HR G2 Jeggo et al, Radiother. Oncol. (2011) Goodarzi et al., DNA Repair (2010) DSB im Heterochromatin ATM-abhängig Öffnung des HC

11 Einfluss der Schadens-Komplexität auf den Reparaturweg: dicht ionisierende Teilchenstrahlen Zellkern Ion C-Ion Zellkern Viele DNA Schäden in räumlicher Nähe DNA nm scale geclusterte Schäden Photonen: Zufällig verteilte Energiedeposition Homogene Dosisverteilung (Röntgen, -Strahlen) locker ionisierend SSB Basenschaden DSB Hohe lokale Energiedeposition Inhomogen verteilt ( -Strahlen; Ionen Schadens-Anhäufung: komplexe DSB dicht ionisierend

12 Akkumulation von Reparaturproteinen an lokalisierten DNA Schäden: Strahlplatzmikroskop Lebendzellmikroskopie: Echtzeit Proteinrekrutierung Auflösung 1 sec 10 min SSB Reparatur (XRCC1) rel. fluorescence signal Kinetiken 53BP1 MDC1 Untersuchung: - Zeitverläufe - Hierarchien -Abhängigkeit time [s] Strahl GFP-Reparatur Protein DSB wandern nicht weiträumig im Kern herum weniger mögliche Wechselwirkungen zwischen Chromosomen stabileres Erbgut Jakob et al., PNAS (2009) Quantitative Unterschiede aufgrund höherer Anzahl an lokalisierten Schäden Schwerionen DSB: gleiche Reparatur Mechanismen wie Photonen Tobias et al. PLOS One in press (2013) Tobias et al. Mutat. Res. (2010)

13 Einfluss der Komplexität der Schäden ( nach Ionenbestrahlung) H2AX DNA Meyer et al., Nucl. Acids Res in rev. Kernweite H2AX Strahlenreaktion an ungeschädigter DNA Messbar auch nach Bestrahlung mit einem Kohlenstoff Ion Entsteht durch Aktivierung der gleichen Kinasen (DNA-PK und ATM) wie H2AX an DSB - keinen Einfluss auf Folgen der Bestrahlung

14 Schadenskomplexität beeinflusst Auswahl des Reparaturwegs HC X-rays C 12 Ionen Chemikalien (Etoposid) X-rays EC komplexe Brüche Reparaturzeit (h) X-rays C 12 Verknüpfung der DNA Enden über Microhomologien Schnelle Reparatur G1 und G2 NHEJ Langsame Reparatur G2 HR Prozessierung der DSB Enden: Resektion N. Averbeck: Komplexe DSB generell Resektion Fehlerbehaftet! Verlust von DNA Shibata et al., Embo J. (2011) Jeggo et al, Radiother. Oncol. (2011)

15 Strahlenreaktion an heterochromatischen (HC) DSB Langsame Reparatur HC-DSB: erschwerte Zugänglichkeit? H2AX Foci immer an Peripherie von HC Bereichen! H2AX DNA 30 min Zellkern (Maus) mit kompaktiertem Heterochromatin 100s merged 2µm rel. Fluorescence Signal GFP Fluoreszenz Lebendzellmikroskop: MEF tim e [s] Zeit (sec) GFP-Reparaturprotein ROT Heterochromatin HC im Vergleich zu EC vergleichbare Akkumulation HC zugänglich! Euchromatin Heterochrom atin 200 EC HC verzögerte Ablösung Prozessierung /Rekombination innerhalb der repetitiven DNA Sequenzen im HC erhöhtes Risiko für falsche Verknüpfungen und fehlerhafte Reparatur B. Jakob et al, Nucl. Acids Res (2011)

16 Relokalisierung heterochromatischer (HC) DSBs Zentraler Focus central intermediate peripheral 100% DNA XRCC1 1 -H2AX 2 x Peripherer Focus z 3D image rel. occurrence Häufigkeit 80% 60% 40% 20% 0% 3-8 min 9-13 min min x post irradiation time Zeit nach Bestrahlung 3D image DSB zentral im HC induziert durch Ionen-Mikrostrahl DSB innerhalb max. 20 min an die Peripherie umgelagert Reparatur findet in aufgelockerten Chromatinbereichen statt! Ziel: Fehlverknüpfungen verhindern beteiligte Faktoren???? B. Jakob et al., Nucl. Acids Res (2011)

17 Limitierend: Zellzykluskontrolle und DSB Reparatur Zellen, die in die nächste Zellzyklusphase eintreten zu bestimmter Zeit nach Bestrahlung G1/S- Kontrollpunkt verzögert G2/M- Kontrollpunkt setzt schnell ein Zellzyklus Kontrollpunkte H2AX DAPI H2AX DAPI Reparaturzeit Zellen teilen sich vor Abschluss der Reparatur (mit DSB) Diese Limitierungen der Zellzykluskontrollpunkte führen zu einer Erhöhung an chromosomalen Brüchen unerwünschten Strahlenfolgen Deckbar et al., Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol.(2011) Deckbar et al., Cancer Res. (2010)

18 Bezug zur BMBF Förderung Ausbildung von Nachwuchswissenschaftlern in der Strahlenforschung, Umgang mit verschiedenen Strahlenquellen Mechanismen der DSB Reparatur für verschiedene Strahlenarten (Schäden unterschiedlicher Komplexität) aufgezeigt gezielte Eingriffe in spezifische Reparaturschritte und Strahlenwirkung Entwicklungen in der Strahlentherapie Auf molekularer Ebene Risiken (Prozessierung/ Zellzykluslimitierung) aber auch Mechanismen zur Erhaltung der Erbgut Information präzisiert (Stabilität DSB, HC-DSB Umlagerung). wichtig zur Beurteilung dieser Balance wie wird sie gesteuert? Vorhersagen zur Risikoabschätzung im Strahlenschutz

19 Projektträger PTKA Danke! Verbundtreffen 02NUK001 UKE