Strahleninduzierte Apoptose bei ESRT im Mausmodell

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1 Strahleninduzierte Apoptose bei ESRT im Mausmodell Die Apoptose ist von vielen ineinandergreifenden Mechanismen abhängig, in deren Regulationsmittelpunkt die Caspasen als ausführende Cysteinproteasen stehen. Klinische Erfolge der extrakraniellen stereotaktischen Radiotherapie (ESRT) führen zur Fragestellung, ob Nekrose und / oder Apoptoseprozesse dafür ursächlich gemacht werden können. Henning Eggert 1, Iris Ernst 1, Burkhard Greve 2, Tobias Bölling 1, Tilmann Spieker 3, Stefan Könemann 1, Klaus Kopka 4, Michael Schäfers 4, Otmar Schober 4, Normann Willich 1, Burkhard Riemann 4 1 Klinik und Poliklinik für Strahlentherapie Radioonkologie, Universitätsklinik Münster, 2 Klinik und Poliklinik für Strahlentherapie Radioonkologie, Abt. für Strahlenbiologie, Universitätsklinik Münster, 3 Gerhard Domagk Institut für Pathologie, Universitätsklinik Münster, 4 Klinik und Poliklinik für Nuklearmedizin, Universitätsklinik Münster

2 Material und Methoden Es wurden Tumorzelllinien des papillären humanen (K1) und des anaplastischen humanen Schilddrüsenkarzinoms (CAL-62) verwendet und nach einer Konfluenz von 80-90% zur s.c. Applikation in 1 ml Spritzen überführt. 2 CD-1 Nude Mäuse wurden zunächst in einem Vorversuch in drei Fraktionen mit einer Dosis von 3 x 12,5 Gy innerhalb einer Woche am CO-60-Gerät partiell bestrahlt und 8 Wochen hinsichtlich der Toxizität dokumentiert. Nach Abschluss dieser Phase wurde 9 BALB/C Nude Mäuse wie im Vorversuch in drei Fraktionen mit 3x 12,5 Gy am CO-60 bestrahlt. Es konnte im Versuchverlauf gezeigt werden, dass BALB/C Nude Mäuse bei s.c. Injektion in die Vorderflanke in Hinblick auf das Tumorwachstum der verwendeten Tumorzelllinien besser ansprechen, als die zuvor verwendeten CD-1 Nude Mäuse. In den Folgeversuchen wurden 20 Tage vor der ersten Radiatio jeweils 5 BALB/C Nude Mäuse pro Zelllinie Tumorzellen in die Vorderflanken appliziert, anschließend erfolgte die Radiatio in oben genannter Dosierung. Am Tag 3 nach der letzten Applikation wurden die Tiere getötet und das Gewebe gewonnen. Zur Darstellung der Caspase-3 im Kleintier-PET/CT wird ein F-18-Isatin-Tracer benutzt. In Vorversuchen wurde die Apoptose über eine Sub G1/G0-Peak Analyse im Durchflusszytometer untersucht, bei der die fragmentierte DNA erfasst wird. Es erfolgte die histologische Aufarbeitung der Gewebeproben mit der TUNEL-Färbung (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dutp nick end-labeling), um nekrotische und apoptotische Zellen zu identifizieren. Mit dieser Methode lassen sich die durch Nukleasen entstandenen DNA-Strangbrüche und die somit freien 3'- OH-Gruppen mit TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase) aufgrund der Fluoreszenz sichtbar machen. Papilläre Schildrüsenkarzinom- Zellen 400 fache Vergrößerung BALB/c Mäuse im Planungsaufbau vor Hochdosisbestrahlung Zur quantitativen Analyse der Gewebeproben wurden die Zellkerne mit DAPI (4,6- Diamidin-2 -phenylindol-dihydrochlorid) eingefärbt und die Gesamtzahl der Kerne ermittelt. Anschließend wurde die Gesamtzahl der TUNEL-positiven Zellkerne automatisiert ausgezählt und mit der Gesamtzahl der DAPI gefärbten Kerne verglichen. Das Ergebnis konnte im Anschluss als prozentualer Anteil an TUNELpositiven Kernen ausgegeben werden. DAPI Färbung

3 Ergebnisse Alle Tiere tolerierten die Radiatio sehr gut, es kam nur zu geringfügigen und kurzeitigen strahlentypischen Reaktionen. Die bisherigen Ergebnisse lassen vermuten, dass es bei ESRT in den Zellen zu einer Apoptose kommt. Bei der histologischen Aufarbeitung konnten in der TUNEL-Färbung apoptotische Zellen nachgewiesen werden. Im Vergleich zwischen bestrahlten Tumoren und nicht bestrahlten Tumoren konnte in der TUNEL-Färbung in der anschließenden Analyse am Lichtmikroskop gezeigt werden, dass bei den bestrahlten Tumoren mehr TUNEL-positive Zellen sichtbar waren, als bei den nicht bestrahlten Tumoren. Die darauf folgende automatisierte Auswertung der TUNEL-Färbungen konnte das vorherige Ergebnis am Lichtmikroskop bestätigten. Tumore, die mit einer Gesamtdosis von 37,5 Gy bestrahlt wurden, wiesen im Verhältniss zu nicht bestrahlten Tumoren einen höheren Anteil an TUNEL-positiven Zellen auf. TUNEL-Färbung eines papillären Schilddrüsenkarzinoms nach Radiatio Bei bestrahlten Tumoren zeigt die FACS- Analyse im Sub G1/G0 Peak einen Anstieg. Im Gegensatz dazu konnte bei nicht bestrahlten Tumoren nur ein geringe Anstieg im Sub G1/G0 Peak verzeichnet werden. Die Ergebnisse der TUNEL-Färbung und der FACS-Analyse lassen bei den bestrahlten Tumoren auf eine vermehrte Apoptose schließen. TUNEL-Färbung eines papillären Schilddrüsenkarzinoms ohne Radiatio

4 Ergebnisse Tumor Kerne gesamt TUNEL-positive Kerne in (%) M1 ATR ,75 M1 PTR ,28 M2 PTR ,62 M3 PT ,87 M5 AT ,68 M6 PT ,20

5 Zusammenfassung Eine Apoptose bei ESRT ist sehr wahrscheinlich. In der FACS-Analyse konnte ein deutlicher Anstieg im Sub G1/G0-Peak der bestrahlten Tumorzellen dargestellt werden, was auf einen apoptotischen Vorgang in den Zellen schließen lässt. Ebenso ließen sich in der TUNEL-Färbung apoptotische Zellen nachweisen. Die Abgrenzung zur Nekrose und zur spontanen Apoptose ohne Radiatio ist noch nicht vollständig abgeschlossen. Ob nekrotische und spontane apoptotische Vorgänge, besonders im Tumorkern bei Tumoren größer 1 cm Durchmesser, nicht alleine schon durch die pathophysiologischen Begebenheiten im Tumorgewebe zustande kommen, muss noch abschließend differenziert werden. Wir gehen davon aus, dass im folgenden Versuchsaufbau mit nicht bestrahlten Tumorzellen und mit der Anwendung des Caspase-3-Tracer im Kleintier-PET diese Abgrenzung gelingen wird. FACS Analyse eines papillären Schilddrüsentumors nach Radiatio Gut vaskuliertes papilläres SD- Karzinom 28 d nach s.c. Zellinjektion TUNEL-Färbung bei einem papillären SD-Karzinom 48h nach Radiatio

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