Gentechnische Methoden

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1 Desmond S. T. Nicholl Gentechnische Methoden 2. Auflage Aus dem Englischen übersetzt von Renate FitzRoy und Kurt Beginnen Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg Berlin

2 Inhalt Vorwort XI Einführung Was ist Gentechnik? Die Grundlagen Die ersten Schritte Der Aufbau des Buches Teil I: Grundlagen der Gentechnik 2r~ ~ Einführung in die Molekularbiologie Der Fluss der genetischen Information Die Struktur von DNA und RNA Die Organisation der Gene Die Genstruktur von Prokaryoten Die Genstruktur von Eukaryoten Die Genexpression Gene und Genome Größe und Komplexität von Genomen Die Organisation von Genomen, Die Arbeit mit Nueleinsäuren Die Isolierung von DNA oder RNA Transport und Mengenbestimmung von Nueleinsäuren Radioaktive Markierung von Nueleinsäuren Die Endmarkierung Die Nicktranslation Markierung durch Primerverlängerung Hybridisierung von Nueleinsäuren Die Gelelektrophorese DNA-Sequenzierung 39

3 VI Inhalt Maxam-Gilbert-Sequenzierung (chemische Sequenzierung) Sanger-Coulson-Sequenzierung (enzymatische oder Didesoxy-Sequenzierung) Elektrophorese und Lesen von Sequenzen Das gentechnische Handwerkszeug Restriktionsenzyme Typ-II-Restriktionsendonucleasen Der Gebrauch von Restriktionsendonucleasen Restriktionskartierung DNA-modifizierende Enzyme Nucleasen Polymerasen Enzyme, die DNA-Enden verändern Die DNA-Ligase Teil II: Methoden der Gentechnik 5. Wirtszellen und Vektoren Die Wirtszellen _ Prokaryotische Wirtszellen Eukaryotische Wirtszellen Plasmidvektoren für E. coli Was sind Plasmide? Standardklonierungsvektoren Ungewöhnlichere Plasmidvektoren v Bakteriophagenvektoren für den Einsatz in E. coli ' Was sind Bakteriophagen? Vektoren, die sich vom Bakteriophagen X ableiten Vektoren, die sich von M13 ableiten Weitere Vektoren Vektorkombinationen aus Plasmid und Phage Vektoren für eukaryotische Zellen Künstliche Chromosomen.' Das Einschleusen von DNA in Zellen Transformation und Transfektion In v//ro-verpackung von Phagen-DNA Andere Arten des DNA-Transfers 87

4 Inhalt VII 6. Klonierungsstrategien Welche Strategie ist am besten? Klonierung mit mrna als Ausgangsmaterial cdna-synthese cdna-klonierung in Plasmidvektoren cdna-klonierung in Bakteriophagenvektoren Klonierung genomischer DNA Genombanken Präparation von DNA-Fragmenten für die Klonierung Ligation, Verpackung und Vermehrung von Genbanken Fortgeschrittene Klonierungsstrategien Synthese und Klonierung von cdna Expression klonierter DNA-Moleküle Klonierung großer DNA-Fragmente in YAC-Vektoren Die Polymerasekettenreaktion (PCR) Die (kurze) Geschichte der PCR Die PCR : Methodik Wesentliche Charakteristika der PCR Die Herstellung von PCR-Primern _ DNA-Polymerasen für den PCR-Gebrauch Ausgefallenere PCR-Techniken PCR mit mrna-matrizen " Nested PCR InversePCR RAPD und weitere Akronyme Die Weiterverarbeitung von PCR-Produkten Anwendungen der PCR Selektion, Screening und Analyse von Rekombinanten Genetische Selektions- und Screeningverfahren Der Einsatz von Farbstoffen Insertionsinaktivierung Komplementation definierter Mutationen Andere genetische Selektionsmechanismen Screening über eine Nucleinsäurehybridisierung Nucleinsäuresonden Screening von Klonbanken Suche nach exprimierten Genen mit immunologischen Methoden Untersuchung klonierter Gene 149

5 VIII Inhalt Charakterisierung über eine in wiro-translation dermrna Restriktionskartierung Blotting-Techniken DNA-Sequenzierung 154 Teil III: Angewandte Gentechnik 9. Die Analyse von Genen und Genomen Untersuchungen zur Genstruktur und -funktion Sequenzanalysen Das Auffinden wichtiger Genelemente Untersuchungen zur Genexpression Vom Gen zum Genom Die Analyse von Genomen Die Kartierung von Genomen Genomsequenzierung Sequenzierungstechniken Genomprojekte Das Humangenomprojekt Wessen Genom wird-analysiert, und wie viele Gene enthält es? Genetische und physikalische Kartierung des menschlichen Genoms Ableitung und Zusammensetzung der Sequenz Wie geht es weiter? Gentechnik und Biotechnologie Die Herstellung von Proteinen Native Proteine und Fusionsproteine Hefeexpressionssysteme Das Baculovirus-Expressionssystem Zelliinien von Säugetieren Proteindesign Beispiele für biotechnologische Anwendungen der rdna-technologie Die Herstellung von Enzymen * DerBST-Fall Therapeutika für den Menschen 200

6 Inhalt IX 11. Medizinische und gerichtsmedizinische Anwendungen der Gentechnik Diagnostik und Charakterisierung von Krankheiten Infektionsdiagnostik Vererbungsmuster Genetisch bedingte Krankheiten Behandlung mithilfe von rdna-technologie - Gentherapie Die Einbringung von Transgenen in Patienten Gentherapie bei Adenosindesaminase-Mangel Gentherapie bei Cystischer Fibröse DNA-Profile Die Geschichte des genetischen Fingerabdrucks" DNA-Profile im Gerichtssaal Die Genetik enthüllt Rätsel aus der Vergangenheit Transgene Pflanzen und Tiere Transgene Pflanzen Grunde für die Produktion transgener Pflanzen Ti-Plasmide als Vektoren für Pflanzenzellen Die Herstellung transgener Pflanzen Die Technologie im Einsatz Transgene Tiere Gründe für die Herstellung transgener Tiere Die Herstellung transgener Tiere Anwendungsmöglichkeiten der Transgentechnologie bei Tieren Vom Klonieren zum Klonen Frühe Gedankenspiele und (Experimente Erste Schritte zum Klonen Die Totipotenz des Zellkerns Von Fröschen, Kröten und Rüben Ein Schaf wird berühmt - der Durchbruch ist gelungen Über Dolly hinaus Schöne neue Welt oder genetischer Albtraum? Kann Wissenschaft ethisch und moralisch neutral sein? Zur Ethikdiskussion Springt Frankensteins Monster aus der Büchse der Pandora? 279