Methoden Sebők Ágnes

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1 Methoden Sebők Ágnes 1

2 2 Molekulare Zellbiologie Molekularbiologische Methode I. DNA

3 3 DNA-Struktur Primärstruktur: Sequenz der Nucleotiden, lineare Polymer, Phosphodiestherbindungen Sekundärstruktur: Doppelhelix, H-BrückenH Tertiärstruktur: Superhelix Quarternärstruktur: DNP, Chromatin

4 4 Sekundärstruktur Die Faltung der Makromolekül Nichtkovalente Bindungen Doppelhelix DNA stabilisiert durch H-BrückenH

5 5 Hybridiesierung In vivo: Enzymatisch (DNA-Replikation, Transcription) In n vitro: Wärme (PCR) alkalische Lösungen (Southern-blot) Formamid und Harnstoff (Sequenzierung)

6 6 Denaturierung: Sekundär- (Tertiär, Quaternär-) struktur nichtkovalente-verbindungen Hydrolyse: Primärstruktur kovalente Verbindungen

7 7 UV-Absorption der DNA Absorptionsmaximum : 260 nm Konzentrationsbestimmung Bei Denaturierung steigt der UV- Absorption

8 8 Schmelztemperatur -T m diejenige Temperatur, bei der sich 50% der DNA-Stränge trennen steigt mit zunehmenden G/C- Gehalt der DNA (3 H-Brücken) H

9 9 Molekularbiologische Methoden Restriktionsendonucleasen Cloning Molecular hybridisation Southern blot Sequencing PCR Genom library

10 10 Filter-Hybridis Hybridisierungierung Denaturierung Filterbindung Hybridiesierung mit der Probe (radioaktive) Waschen Radiokativität messen Fragen: Anwesenheit der komplementäre Strang Quantität der komplementären DNA/RNA

11 11 In situ Hybridisierung ierung Mikroskopisches Preparat Denaturierung Hybridiesierung mit der Probe (fluorescent) Waschen Fluorescent Mikroskop (Lichtmikroskop) Fragen: Anwesenheit des komplementären Stranges Wo?

12 12 Die Restriktionsendonuclease Nuclease schneidet Phosphodiesterbindungen in Nucleinsäure Endo/Exo Nuclease Restriktion Erkennungstellen bzw. Bakterielle Restriktion- Modifikations-System

13 13 Die Restriktionsendonuclease dsdna-specifische specifische Endonuclease, mit einer specifischen Erkennungssequenz sequenz Palindrom adhäsive e oder glatte Ende

14 14 Restriktionskarten Verdau mit RE Agarose Gelelectrophorese Wanderung zur positiven Electrode Größere Fragmente wandern langsamer Fluoreszierende Farbstoff die an DNA bindet Relative Lagerung der RE- Erkennungsequenzen kann determiniert werden.

15 15 In Vitro DNA-Synthese DNA-Polymerase DNA-Matrize Primer 4 dntps, ein radioaktiv markiert Puffer ****** Separierung der freien Nucleotiden von DNA-Strangen

16 16 Enzymatische DNA-Sequenzierung In vitro DNA-Synthese Primer (oder dntp) ) radioaktiv markiert ddntp (die 3 -OH3 OH-Gruppe fählt) 4 in vitro Reaktionen mit 4 verschiedenen ddntps (1:10) Denaturierende Electrophorese (PAGE mit Harnstoff und Formamide) Autoradiographie

17 17 Polymerasekettenreaktion (PCR) In vitro DNA-Synthese Hitzestabile DNA-Polymerase Primer-Paar Paar Zyklen: 1. Denaturierung (95 C) 2. Primer-Bindung (60 C) 3. Primer-Verlängerung (60-70 C) Gelelectrophorese

18 18 PCR Existenz einer Sequenz in der DNA-Mischung Klonierung (Amplifizierung) Länge der DNA-Fragment - Mutationsanalyse

19 19 Molekulare Zellbiologie Molekularbiologische Methode - Genexpression

20 20 Polymerasekettenreaktion (PCR) In vitro DNA-Synthese Hitzestabile DNA-Polymerase Primer-Paar Paar Zyklen: 1. Denaturierung (95 C) 2. Primer-Bindung (60 C) 3. Primer-Verlängerung DNA synthese (60-70 C) (Gelelectrophoresis)

21 21 PCR - Anwendung (Fragen) Existenz einer Sequenz (Infections,, Krebs) Klonierung (Amplifizierung) Mutationsanalyse (Länge der DNA-Fragment) Quantität einer Sequenz Real-time PCR

22 22 Real-time PCR In vitro DNA-Synthese Hitzestabile DNA-Polymerase Primer-Paar Paar Dritte Primer : mit fluroreszent Farbsott und Auslöscher Polimerase macht fluoreszent Farbstoff frei gleichzeitige (real( real-time) Quantifikation

23 23 Genexpression Transcription Translation Protein-Function DNA mrna Protein Phenotyp

24 24 Gentechnik in vivo I. Expression von fremden Genen II. Hinderung der endogenen Gen- Expression

25 25 Gentechnik in vivo 1. Expression von fremden Genen Gen-Transfer in Zelle Transgene Organisme

26 26 Hinderung der endogenen Genexpression I. I. DNA KO-mutation

27 27 Hinderung der endogenen Genexpression II. II. RNA Antisense Antisense RNA Ribosyme RNA-Interferenz

28 28 Hinderung der endogenen Genexpression III. III. Proteine Microinjection von Antikörper Intrazellulläre Antikörper Expression von dominanten hemmenden Proteinen Peptidomimetiken

29 mrna Sebők Ágnes 29

30 30 Molekulare Zellbiologie Transcription und Processing der mrna

31 31 Transcription der mrna RNA Polymerase II. Nucleoplasma Primärtranscript ärtranscript: pre-mrna = hnrna Untereinheiten: Histon-acetyltransferase Helicase Posttranscriptionale Modifizierungen (heterogen nuclearuclear RNA)

32 32 Promoter: Initiation der mrna-synthese Core P: TATA-box Enhancer Transcriptionsfaktoren sfaktoren allgemeine regulatorische

33 RNA-Capping Sebők Ágnes 33 Enzyme: Nucleotide Phosphohydrolase Guanyltransferase Methyltransferase 5 -Ende 5-5 Verknüpfung, Triphosphat-Brücke Function: Stabilität der mrna (histon mrna-s ohne poly-a) Export aus dem Zellkern Ribosome-Bindung (Proteinsynthese)

34 34 Polyadenierung 3 -Ende Poly-A Signalsequenz Endonuclease Poly-A-Polymerase Polymerase Poly(A) ) Schwanz: Ns. Function: Stabilität der mrna Export aus dem Zellkern

35 35 Struktur der pre-mrna und mrna Intron Exon 5 und 3 -nichtkodierender Bereich Cap und poly-a-schwanz

36 36 RNA-Spleißen Introns Entfernen und Exons miteinander verbinden 5 und 3 Spleiße-Signalsequenzen Signalsequenzen snrnp: Rybosym

37 37 RNA-Sp Spleißmechanismus 5 - U1 ; 3 U2 U4/U6 und U5 Schnitt an der 5 -Spleisstelle Lariatbildung (Schlaufe) Schnitt an der 3 -Spleisstelle Verbindung der Exonsequenzen

38 38 Spleißung-Krakheiten SLE (systemische Lupus erythematodes) Autoimmunerkrankung Anti-snRNP snrnp-antikörper Thalassemia Anaemia: α und β Globin-Synthese ist ruduziert Mutation der Spleisstelle

39 Replikation Sebők Ágnes 39

40 40 Molekulare Zellbiologie Replikation der DNA

41 Das Kornberg-System Matrize-DNA DNA-Polymerase 4 dntp (ein radiaoaktiv markiert) Puffer-Lösung Sebők Ágnes 41

42 Das Kornberg Sebők Ágnes 42 ο Synthese Experiment o TCA-Precipitierun Precipitierung o o o Filter-Bindung Waschen (TCA) Messung der

43 Das Kornberg Sebők Ágnes 43 Experiment 1. DNA ist in vitro synthetisiert (Die Filter ist radioaktiv) 2. DNA Synthese ist Matrize- abhängig (A+T/G+C - Ratio der Matrize- und neu-synthetisierte- DNA identisch)

44 44 Das Meselson-Stahl 14 Experiment 14 N-DNA leicht, 15 N-DNA schwer Die Zellen wachsen zuerst im 15 N dann im 14 N-Medium ProbenProben aus der Kultur nach jeder DNA-Replikation

45 45 Bidirektionale Replikation Replikationsursprung (Origin) Faserautoradiographie 3 H-Markierung (hei( heiß ß danach warm) DNA-Isolation Lichtmikroskopische Autoradiographie

46 46 Semikonservativ Replikation in eukaryontischen Zellen H3-Thymidin Markierung wahrend der S-Phase und Entfernung des Isotops (Pulse- Chase) Proben nach jeder Replikation Autoradiographie der

47 5 >3 Richtung der DNA- PCR: Synthese Primers: Amplifizierung,, 2 n Primers: Duplizierung,, 2n Sebők Ágnes 47

48 48 PCR: DNA-Synthese ist Primer- abhangig Keine Synthese ohne Primers Synthese der DNA-Strecke zwischen der Primers

49 49 DNA-Synthese ist bidirektional Replikationsursprung (Origin) Faserautoradiographie Faserautoradiographie: 3H-Markierung (heiss( danach warm) DNA-Isolation

50 50 Faserautoradiographie Bidirektionale Synthese: warm heiß zero heiß warm Hypothetische unidirektionale

51 51 DNA-Replikation ist semidiskontinuirlich Leitestrang, Folgestrang DNA-Ligase Okazaki-Experiment Experiment: 3H-Thymidin-markierung markierung von Bakterien Isolation der DNA

52 52 Eigenschaften der DNA- Replikation (Zusammenfassung) 1. Matrize-abhangig abhangig Kornberg-E. 2. dntp Kornberg- E. 3. Semikonservativ Meselson-