1.4 Eigenschaften der Nucleinsäuren

Transkript

1 6 Nucleinsäuren, Chromatin und Chromosomen.4 Eigenschaften der Nucleinsäuren Aufgrund ihrer Struktur besitzen Nucleinsäuren einige besondere Eigenschaften. Dazu gehört das unterschiedliche Absorptionsverhalten von ultraviolettem Licht bei einzel- bzw. doppelsträngigen DNA- und RNA-Molekülen, die künstlich durch physikalische oder chemische Faktoren induzierbare De- bzw. Renaturierung von doppelsträngigen Nucleinsäuren, die Grundlage vieler genetischer Methoden ist, und die Ausbildung von besonderen Sekundärstrukturen wie Haarnadelschleifen. Bei ringförmigen DNA-Molekülen ergeben sich topologische Besonderheiten..4. Absorption von ultraviolettem Licht Aufgrund des aromatischen Charakters der Basen absorbieren Nucleinsäuren ultraviolettes Licht. Die Zuckerreste und die Phosphatgruppen der Nucleotidketten tragen nicht merklich zur Absorption bei. Die maximale Absorption der DNA und der RNA liegt bei 260 nm (Abb..9); man bezeichnet sie daher als A 260. Die Absorption ist für einzeln vorliegende Nucleotide am größten, erreicht ein mittleres Niveau für einzelsträngige DNA und ist am geringsten für doppelsträngige DNA. Die zunehmend engere Nachbarschaft der Basen in der DNA-Doppelhelix im Vergleich zu einzelsträngiger DNA führt zur Abnahme der Absorption, die als Hypochromie bezeichnet wird. Doppelsträngige DNA ist also hypochrom im Vergleich zu einzelsträngiger DNA und RNA. Die OLE_LINK»OLE_LINK2»A 260 einzelsträngiger RNA ist um 37 % höher als die doppelsträngiger DNA (Abb..9). Die Absorption der DNA wird auch genutzt, um die DNA-Konzentration in einer Lösung anzugeben. Eine Lösung mit mg ml doppelsträngiger DNA hat eine A 260 von 20. Der entsprechende Wert für einzelsträngige DNA und RNA ist etwa 25. Diese Werte werden aber etwas von der Basenzusammensetzung beeinflusst, da Purinbasen eine höhere Absorption besitzen als Pyrimidinbasen. Abb..9 A 260. Das Absorptionsverhalten verschiedener Nucleinsäuren im ultravioletten Licht zeichnet sich durch ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von 260 nm aus. Doppelsträngige DNA ist hypochrom zur RNA.

2 .4 Eigenschaften der Nucleinsäuren Schmelzen und Renaturierung der DNA Erhöht man die Temperatur einer DNA-haltigen Lösung, werden die Wasserstoffbrücken-Bindungen zerstört und die beiden Stränge trennen sich voneinander zu Einzelstrang-DNA. Mit zunehmender Temperatur entstehen immer mehr einzelsträngige Bereiche. Dabei nimmt wegen der oben beschriebenen Hypochromie die Absorption von kurzwelligem Licht in der Lösung zu. Wenn A 260 gegen die Temperatur aufgetragen wird, erhält man eine Schmelzkurve der DNA. Als Schmelzpunkt der DNA (T m ) bezeichnet man die Temperatur, bei der das Maximum von A 260 gerade zur Hälfte erreicht ist (Abb..0). T m steigt mit zunehmendem GC-Gehalt an, da GC-Paare wegen der sie verbindenden drei Wasserstoffbrücken-Bindungen schwerer zu trennen sind als AT-Paare. Die Herstellung einzelsträngiger DNA wird auch als Denaturierung bezeichnet. Dies kann durch erhöhte Temperatur oder der Zugabe bestimmter Chemikalien wie Harnstoff (H 2 NCONH 2 ) oder Formamid (HCONH 2 ) erreicht werden. Bei der Renaturierung, auch als Reassoziation oder Annealing bezechnet, lagern sich die komplementären DNA-Stränge wieder aneinander. Dieser Prozess Abb..0 Schmelzkurve. Mit zunehmender Temperatur treten immer mehr einzelsträngige DNA-Abschnitte auf. Die Absorption bei 260 nm erhöht sich. Wenn nur noch einzelsträngige DNA-Abschnitte vorliegen, steigt die Absorption nicht mehr weiter an. Der Schmelzpunkt T m der DNA liegt bei der halbmaximalen Absorption der Einzelstrang-DNA.

3 8 Nucleinsäuren, Chromatin und Chromosomen kann durch die Wahl der Pufferbedingungen (ph-wert bzw. Salzkonzentration), vor allem aber der Temperatur beeinflusst werden. Meist erfolgt die Renaturierung bei einer Temperatur etwa 20 hc unterhalb von T m. Die Wahl der richtigen Annealing-Temperatur ist ein wichtiger Parameter bei der PCR (S. 484). Nach vollständiger Renaturierung hat die DNA wieder den ursprünglichen Schmelzpunkt. Fehlpaarungen (mismatches) zwischen den beiden komplementären Strängen äußern sich in einer erniedrigten Schmelztemperatur. Wenn in Experimenten zur Renaturierung ausreichend komplementäre einzelsträngige DNA aus einer anderen Stelle desselben Genoms oder von einer anderen Spezies eingesetzt wird, spricht man von Hybridisierung. Unter geeigneten Bedingungen können auch stabile DNA-RNA-Hybride gebildet werden. Die Bedingungen bei einer Hybridisierungsreaktion werden unter dem Begriff Stringenz (stringency) zusammengefasst. Wenn die Stringenz hoch ist, d. h. bei einer Temperatur von etwa 42 hc und hohen Formamidkonzentrationen (z. B. 50 %), werden die DNA- Proben nur bei perfekter Komplementarität hybridisieren. Bei niedriger Stringenz, d. h. in Anwesenheit von z. B. 35 % Formamid, wird dagegen eine größere Zahl von Fehlpaarungen toleriert. Wenn die beiden zu hybridisierenden DNA- Proben völlig komplementär sind, wird man unter Bedingungen von hoher Stringenz hybridisieren, um den Hintergrund an Fehlpaarungen niedrig zu halten. Hybridisierung bei geringer Stringenz ist zu empfehlen, wenn der Grad der Komplementarität der beiden DNA-Proben nicht bekannt ist. Mithilfe der Hybridisierung können experimentell komplementäre DNA-Sequenzen nachgewiesen werden, wenn man einen der Reaktionspartner radioaktiv oder durch Einbau einer fluoreszierenden Verbindung markiert hat (S. 492). Dieser Reaktionspartner einer Hybridisierungsreaktion wird als Sonde bezeichnet..4.3 Haarnadelschleife Es gibt in der DNA Konformationen, die an das Vorliegen bestimmter DNA-Sequenzen gebunden sind. Tritt eine beliebige Basensequenz zwei Mal in umgekehrter Orientierung in einiger Entfernung voneinander in einem DNA-Doppelstrang auf, spricht man von einem Inverted Repeat. Ein Palindrom ist ein Spezialfall des Inverted Repeat, bei dem zwei identische Basensequenzen, eine davon in umgekehrter Orientierung, sehr nahe hintereinander auftreten, also kreuzspiegelsymmetrisch in Bezug auf die Einzelstränge oder komplementär sind (Abb..). Solche Sequenzwiederholungen sind im Genom nicht ungewöhnlich, und in beiden Fällen kann sich dann durch Paarung der komplementären Basen eine Haarnadelschleife (hairpin loop, stem loop) bilden. Es entsteht eine kreuzförmige DNA. In entspannter DNA ist diese Konformation energetisch allerdings ungünstig. Viele Bakterien und Viren besitzen ringförmige doppelsträngige DNA, an der sich topologische Besonderheiten der DNA gut demonstrieren lassen. Die beiden komplementären Stränge der DNA liegen hier als Ringe vor und sind ent-

4 .4 Eigenschaften der Nucleinsäuren 9 Abb.. Palindrom. In diesem DNA-Element ist dieselbe DNA-Sequenz in umgekehrter Orientierung, nur von drei Basenpaaren getrennt, hintereinander angeordnet. Unter dieser Voraussetzung ist eine kreuzförmige Konformation zwar möglich, aber energetisch ungünstig. sprechend der helikalen Natur der DNA umeinander gewunden. Um die beiden Stränge voneinander zu trennen, müsste man die DNA in jeder Windung einmal durchschneiden. Dieser Wert wird als Linking Number, L k, bezeichnet und entspricht bei entspannter DNA der Zahl der Windungen in der Doppelhelix, den Helical Twists, T w. Bei entspannter DNA gilt also L k =T w (Abb..2). Durchtrennt man jetzt einen Strang in einem doppelsträngigen DNA-Ring, nimmt zwei Windungen heraus und fügt die Enden wieder zusammen, haben in diesem Ring sowohl L k als auch T w um den Wert 2 abgenommen (Abb..2). Dieser Ring ist instabil. Um eine vollständige Basenpaarung zu erreichen und eine durchgehende Doppelhelix auszubilden, nimmt er eine negativ superhelikale Konformation ein. Es treten zwei rechtsgängige Windungen auf, für die man einen weiteren Begriff, die Superhelizität (Supercoiling) oder Writhing Number, W r, eingeführt hat. Es gilt L k =T w +W r.w r liegt nach dem eben geschilderten topologischen Manöver bei einem Wert von 2 (negatives Supercoiling). In elektronenmikroskopischen Präparationen isolierter Plasmide ( Mikrobiologie) finden sich entspannte und superhelikal gewundene Ringe nebeneinander (Abb..2a). Sie stellen topoisomere Formen eines DNA-Moleküls dar.

5 20 Nucleinsäuren, Chromatin und Chromosomen Abb..2 Topologie. a TEM-Aufnahme von gespreiteten Plasmiden (pbr322 aus Escherichia coli). Neben einem entspannten Ring (großer Pfeil) liegen zwei superhelikal gewundene Plasmide vor (kleine Pfeile). (Foto von D. Kapp, Bielefeld.) b Eine doppelsträngige ringförmige DNA wird um zwei Windungen entwunden. Um sich zu stabilisieren, nimmt das Molekül eine superhelikale Konformation ein. Die Enzyme, die für die Bildung der topoisomeren Formen verantwortlich sind, bezeichnet man als Topoisomerasen. Topoisomerasen sind essentiell für die Veränderung der Topologie der DNA und daher Angriffspunkt für Antibiotika und Cytostatika. Die eben geschilderte Herstellung eines superhelikal gewundenen DNA-Rings wird von der Topoisomerase I vermittelt. Sie vermag einen der beiden Stränge einer doppelsträngigen DNA auf der Höhe der Phosphodiesterbindung zu durchtrennen, den intakten Strang durch diese Lücke hindurchzuführen und die Enden wieder miteinander zu verbinden. Die Topoisomerase II, auf die bei der Besprechung der Struktur eukaryotischer Chromosomen noch einmal eingegangen wird (S. 29), ist in der Lage, doppelsträngige DNA zu zerschneiden, einen anderen DNA-Doppelstrang durch den Spalt zu führen und die Lücke wieder zu schließen; diese Reaktion ist ATP-abhängig. Die Topologie von negativ superhelikal gewundenen DNA-Ringen kann von außen durch die Temperatur und die Ionenstärke der Lösung beeinflusst werden. Wichtiger ist aber der Einfluss von sogenannten interkalierenden Verbindungen. Das bekannteste Beispiel dafür ist das Ethidiumbromid. Der polyzyklische Aromat lagert sich zwischen die Basenpaare ein (Interkalation). Dabei nimmt die UV-induzierte Fluoreszenz des Ethidiumbromids dramatisch zu. Wegen dieser Eigenschaft benutzt man Ethidiumbromid zum Anfärben von DNA in Gelen. In Folge der Einlagerung von Ethidiumbromid in die DNA werden negativ superhelikal aufgewundene Ringe in die entspannte Ringform übergeführt. Bei weiterer Erhöhung der Konzentration an Ethidiumbromid entstehen dann im Gegensinn (positiv) superhelikal aufgewundene DNA-Ringe. Hypochromie: Absorptionsverhalten von Nucleinsäuren bei 260 nm. Maximale Absorption nimmt von Nucleotiden, über RNA, einzelsträngige DNA bis zur doppelsträngigen DNA ab.

6 .5 Organisation der prokaryotischen Chromosomen 2 Denaturierung: Zunehmende Auflösung der Wasserstoffbrücken zwischen den Strängen der Doppelhelix mit steigender Temperatur, wird über zunehmende Absorption bei 260 nm (A 260 ) gemessen, kann in Form einer Schmelzkurve dargestellt werden. Schmelzpunkt (T m ): bezeichnet Temperatur, bei der A 260 halbmaximal ist. T m steigt mit zunehmendem GC-Gehalt. Kann auch durch Chemikalien wie Harnstoff und Formamid bewirkt werden, umkehrbar (Renaturierung, Reassoziation). Hybridisierung: Form der Renaturierung. DNA-Einzelstränge sind unterschiedlicher Herkunft. Es können auch DNA-RNA-Hybride ausgebildet werden. Stringenz: Experimentelle Bedingungen, die die Ausbildung eines stabilen DNA- DNA-, DNA-RNA- oder RNA-RNA-Hybridmoleküls erlauben. Variierbare Parameter: Temperatur während der Hybridisierung, Temperatur während des Waschvorgangs, Salzkonzentration des Waschpuffers. Je niedriger die Stringenz, desto mehr Fehlpaarungen im Hybridmolekül, je höher die Stringenz, desto weniger Fehlpaarungen werden toleriert. Inverted Repeat: Identische Basensequenzen, die in einiger Entfernung voneinander und in umgekehrter Orientierung zueinander in einem DNA-Doppelstrang auftreten. Palindrom: Identische Basensequenzen, die in umgekehrter Orientierung sehr nahe hintereinander in einem DNA-Doppelstrang auftreten. Basensequenzen bilden so eine kreuzspiegelsymmetrische Anordnung bzw. sind zueinander komplementär. Durch Paarung der komplementären Basen kann eine Haarnadelschleife entstehen. Haarnadelscheife (hairpin loop, stem loop): Kreuzförmige DNA-Struktur, entsteht durch Basenpaarung zwischen komplementären DNA-Sequenzen innerhalb eines DNA-Stranges. In entspannter DNA energetisch ungünstige Konformation..5 Organisation der prokaryotischen Chromosomen Viele Archaea und Bacteria enthalten ein ringförmiges Chromosom, das in einem abgegrenzten Bereich der Zelle, dem Nucleoid, vorliegt. Prokaryotische Chromosomen sind sehr viel länger als die Zellen und müssen daher stark kompaktiert werden. Dies geschieht durch generelle DNA-Bindeproteine, die klein und positiv geladen sind und daher als histon-ähnliche Proteine bezeichnet werden. Viele archaeale Arten enthalten Histone, die homolog zu eukaryotischen Histonen sind..5. Organisation der Genome von Bakterien Mit einer Länge von knapp,6 mm ist das ringförmig vorliegende doppelsträngige DNA-Molekül, auch als Bacteria-Chromosom bezeichnet, des Darmbakteriums Escherichia coli, ungefähr tausendmal länger als die Bakterienzelle selbst.