Struktur von Nukleinsäuren

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1 Struktur von Nukleinsäuren Woraus besteht DNA? James D. Watson & Francis H. C. Crick entwarfen 1953 mithilfe der Daten von Chargaff und der Röntgenkristallographie-Daten von Rosalind Franklin und Maurice Wilkins das Modell der DNA-Doppelhelix. Hinweis: Im Atelier finden Sie beim Posten "Geschichte" interessante Berichte über die Aufklärung der Struktur der DNA, darunter auch Originalliteratur ( Dokument G1 Die DNA- Doppelhelix ). DNA, die Desoxyribonukleinsäure, und die heterogene Gruppe der RNAs, Ribonukleinsäuren, gehören in die Familie der Nukleinsäuren. Nukleinsäuren bestehen ganz allgemein aus drei Bausteinen: aus einem Zucker, einer Phosphorsäure und aus Basen. Betrachten wir vorerst nur die DNA: Die DNA enthält als Zucker - wie schon der Name vermuten lässt - 2-Desoxyribose, ein C5- Kohlenhydrat. Die Hydroxylgruppe am zweiten C-Atom fehlt, so dass zur Verknüpfung der anderen Bausteine nur noch drei Möglichkeiten zur Verfügung stehen, nämlich die Hydroxylgruppen an C1, C3 und C5: Die Phosphorsäure ist mit zwei Zuckern verestert. Sie verbindet das C3 der einen Desoxyribose mit dem C5 einer andern. Indem auf jede Phosphorsäure ein Zucker folgt und auf diesen wiederum eine Phosphorsäure, entsteht ein langes, lineares Molekül. Nur an einem der beiden Enden, am sogenannten 5'-Ende (sprich: 5 Strich), befindet sich eine Phosphorsäure. Das andere 1

2 Ende, entsprechend 3'-Ende genannt, ist eine Desoxyribose, welche als einzige am C3 nicht verestert ist. Unsere Zucker-Phosphat-Kette erhält so eine Richtung: Die DNA enthält (neben Zucker und Phosphat) vier Basen, die man aufgrund ihrer Struktur in Purine und Pyrimidine unterteilt. Purine bestehen aus zwei Ringen (einem 6- und einem 5-Ring), Pyrimidine haben nur einen Ring, den 6-Ring: Die in der DNA regelmässig vorkommenden Basen sind die Purine Adenin und Guanin, sowie die Pyrimidine Thymin und Cytosin. Die ebenfalls aufgeführte Pyrimidin-Base Uracil kommt nur in der RNA vor. 2

3 Wie sind die Basen mit den andern Bausteinen verknüpft? Wie auf dem Bild (Struktur der Purine und Pyrimidine) gezeigt, sind zwei der drei Hydroxylgruppen der Desoxyribose bereits mit der Phosphorsäure verestert, so dass die Verbindung Zucker-Base nur noch über C1 erfolgen kann. Da die Koppelung über N9 bei den Purinen bzw. über N1 bei den Pyrimidinen erfolgt, nennt man die Bindung N-glykosidisch. Die Primärstruktur An jede Desoxyribose ist eine der vier Basen (Adenin, Guanin, Cytosin oder Thymin) N- glykosidisch gebunden. Die Abfolge der Basen kann beliebig variieren und stellt die eigentliche Erbinformation dar. So ist es möglich, dass die DNA (trotz ihres einfachen Baus) Träger von Information ist! Die Sequenz der Basen einer Nukleinsäure nennt man Primärstruktur. Sie liest sich vereinbarungsgemäss immer von 5' nach 3'. Als Beispiel sei ein DNA-Einzelstrang mit der Basenfolge 5'-Adenin-Thymin-Guanin-3' gezeigt: Die Sekundärstruktur In Zellen existiert ein DNA-Einzelstrang jeweils nur kurzfristig und nur über kurze Abschnitte, z.b. während der Zellteilung oder während der Transkription. Normalerweise paart sich ein DNA-Einzelstrang nämlich immer mit einem zweiten Einzelstrang. Diese Paarung ergibt sich dadurch, dass immer eine Base des einen Einzelstrangs mit einer bestimmten Base des anderen Strangs Wasserstoffbrücken ausbildet. Die beiden Basen, welche sich gegenüberstehen, nennt man komplementär. Adenin paart sich mit Thymin, Guanin mit Cytosin: 3

4 Sehen Sie sich die Basenpaare etwas genauer an: einer Purin-Base steht immer eine Pyrimidin- Base gegenüber und umgekehrt. Das bedeutet, dass in der DNA immer gleichviele Purine wie Pyrimidine eingebaut sind. Diese als Chargaff-Regel bekannte Tatsache besagt auch, dass die Summe der Adenine gleich der Summe der Thymine und die Summe der Guanine gleich der Summe der Cytosine ist: A + G = T + C A / T = G / C = 1 Die Sekundärstruktur einer Nukleinsäure wird durch die Abfolge komplementärer Basen bestimmt. Im Falle der DNA bleiben die Doppelstränge nicht einfach in einer Ebene, vielmehr verdrillen sie sich schraubenartig zu einer Doppelhelix, wobei die hydrophoben Basen innen liegen, die Zuckerringe und die Phosphodiesterbrücken hingegen das Rückgrat bilden und aussen liegen: Die DNA-Doppelhelix hat folgende Eigenschaften: Sie dreht nach rechts und hat einen Durchmesser von etwa 2 nm. Der Abstand zwischen zwei benachbarten Basen beträgt 0,34 nm und der helicale Drehungswinkel der benachbarten Basenpaare beträgt 36. Das ergibt pro Umdrehung 10 Basenpaare und eine Hubhöhe von 3,4 nm. Die planaren Basen liegen horizontal übereinander und können durch diese Stapelung ("base stacking") die Konformation der DNA stabilisieren. Weil sich die Zucker-Base-Bindungen der komplementären Basenpaare nicht direkt gegenüber liegen, also nicht diametral zueinander stehen (ihr Abstand beträgt weniger als der Durchmesser der Helix, vergl. obige Skizze), sind die vertikalen Abstände zwischen den beiden 4

5 Einzelsträngen der DNA nicht immer gleich gross, sie bilden entweder eine kleine oder eine grosse Grube. Die beiden Einzelstränge der DNA sind zueinander antiparallel angeordnet, d. h. das 5'-Ende des einen Strangs liegt dem 3'-Ende des andern gegenüber und umgekehrt. Durch die Basenpaarung ergibt sich, dass aus der Basenfolge des einen Strangs zwingend die Basenfolge im andern (komplementären) Strang bestimmt werden kann. Uebung: Sie können dies an einem einfachen Beispiel üben: Versuchen Sie aus folgender DNA- Sequenz den komplementären Strang zu finden: Lösung: S. 13 5'-AATCAGCGATCGCTG-3' Hinweise: Vergewissern Sie sich, dass Sie alle Eigenschaften der gezeigten DNA verstehen. Sie ist die am häufigsten vorkommende Konformation der DNA und wird als B-Form bezeichnet: siehe Stereobild auf dem Plakat. Man kann das Stereobild auch ohne eine Stereobrille als ein einziges, räumliches Bild sehen, wenn man es durch Üben schafft, zwei normalerweise miteinander verknüpfte Sehreflexe zu entkoppeln. Man muss die Augen streng parallel stellen, als wären sie auf ein fernes Objekt gerichtet, die Augenlinsen aber zugleich für nahes Sehen fokussieren:achtung! Beim Betrachten des Stereobildes ohne Stereobrille dreht die Helix nach links statt nach rechts! Sie können sich die Struktur der DNA wahrscheinlich am besten vorstellen, wenn Sie das dreidimensionale Modell zuhilfe nehmen. Im Atelier finden Sie ein DNA-Modell. Es zeigt eine vollständige Helixwindung einer B-DNA im Masstab 1:10 8 ; der Durchmesser des Modells beträgt also 20 cm (1 nm entspricht ungefähr 10 cm). Versuchen Sie, die folgenden Fragen zu beantworten: Welches ist die Phosphorsäure, welches der Zucker? Sehen Sie die grosse und die kleine Grube? Wo liegt das 3'- und wo das 5' - Ende eines Stranges? Sehen Sie, wie die Basen übereinandergestapelt und gegeneinander versetzt sind? Betrachten Sie ein Basenpaar: welches ist die Purinbase und welches die Pyrimidinbase? Vielleicht erkennen Sie die Basen sogar und damit die Basensequenz! Die Basensequenz eines DNA-Abschnitts bestimmt, welche Konformation die Doppelhelix annimmt. Alternative Konformationen sind wichtig für die Erkennung bestimmter Abschnitte durch Eiweisse (z.b. bei der Replikation der Transkription), weil die Basen dadurch für Eiweisse besser zugänglich gemacht werden. A-DNA: Sie kommt z.b. als Intermediäres bei der Transkription vor (DNA/RNA-Helix). Die zusätzliche Hydroxylgruppe am C2 der Ribose verhindert, dass das DNA-RNA-Hybride die B- Konformation annehmen kann. Aus demselben Grund kommt die A-Form auch bei doppelsträngiger RNA vor (z.b. in Viren). Die A-Form ist zwar ebenfalls rechtsdrehend, sie ist aber "dicker" als die B-Form und beide Gruben sind etwa gleich gross: siehe Stereobild auf dem Plakat. Z-DNA: Alternierende Purin-/Pyrimidinsequenzen wie z.b. 3 -CGCGCGCGCG-5 5 -GCGCGCGCGC-3 5

6 bilden eine linksdrehende Doppelhelix, welche etwa 12 Basenpaare pro Umdrehung hat. Die Z- DNA verdankt ihren Namen ihrem "zick-zack"-artigen Zucker-Phosphat-Rückgrat: siehe Stereobild auf dem Plakat. Woraus besteht RNA? RNA ist eine heterogene Gruppe von Nukleinsäuren, deren Aufgabe es ist, Information in der DNA in Proteine umzusetzen. Die verschiedenen Klassen (trna, rrna, hnrna und mrna) werden deshalb erst bei den Kapiteln Transkription und Translation genauer erläutert. Hier sei vorerst nur der allgemeine Bau aufgezeigt. Die Ribonukleinsäure, kurz RNA, ist grundsätzlich gleich gebaut wie DNA, zeigt aber einige wichtige und interessante Unterschiede, welche zum Teil schon erwähnt worden sind: als Zucker dient Ribose, nicht 2-Desoxyribose die Pyrimidin-Base Uracil ersetzt Thymin. Alle andern Basen bleiben dieselben RNA besteht (in der Regel) nur aus einem Einzelstrang; es treten aber intramolekulare Basenpaarungen auf, wobei sich Adenin mit Uracil, Guanin mit Cytosin paaren Nukleoside und Nukleotide Purine und Pyrimidine sind nicht nur Bestandteile von Nukleinsäuren, sondern auch von Energieträgern im Cytosol, den sogenannten Nukleotiden, welche z.b. bei diversen Biosynthesen, bei Membrantransporten oder bei Muskelarbeit essentiell sind. 6

7 Sind nur Zucker und Base im Molekül vorhanden, sprechen wir von einem Nukleosid; ist am C5 noch ein Phosphorsäure-Rest gebunden, sprechen wir von einem Nukleotid: Nukleosid: Base + Zucker Nukleotid: Base + Zucker + Phosphat Für die diversen Verbindungen ergeben sich dadurch folgende Bezeichnungen: freie Base Nukleoside 1 Nukleotide 2 Adenin (A) Adenosin Adenosinmonophosphat (AMP) Guanin (G) Guanosin Guanosinmonophosphat (GMP) Cytosin (C) Cytidin Cytidinmonophosphat (CMP) Thymin (T) Thymidin Thymidinmonophosphat (TMP) Uracil (U) Uridin Uridinmonophosphat (UMP) 1 Nukleoside enden bei den Purin-Derivaten auf -osin, bei den Pyrimidin-Derivaten auf -idin. Enthalten Nukleoside Desoxyribose als Zucker, nennt man sie Desoxynukleoside; entsprechendes gilt auch für die Nukleotide (Abkürzung: damp, dgmp,... ) 2 Nukleotide können mit einem, zwei oder gar drei Phosphorsäure-Resten verknüpft werden. Entsprechend nennt man zum Beispiel die Adenin-Derivate Adenosinmonophosphat (AMP), Adenosindiphosphat (ADP) und Adenosintriphosphat (ATP). Als Beispiel für ein Nukleotid sei im folgenden Adenosintriphosphat (ATP) gezeigt, der wichtigste Energiespeicher und -überträger des Intermediärstoffwechsels: 7

8 Nukleinsäuren sind also unverzweigte, lineare Biopolymere aus Nukleotid-Monophosphaten, wobei damp, dgmp, dcmp und dtmp die Bausteine für die DNA, und AMP, GMP, CMP und UMP diejenigen für die RNA darstellen! Folgende Darstellung veranschaulicht diesen Sachverhalt: B = Base, Z = (Desoxy)-Ribose, P = Phosphat Hinweis: Sie haben die Möglichkeit, in der Videoecke den Videofilm Struktur von Nukleinsäuren (Dauer: 4.5 Min.) anzuschauen. Eer fasst das bisher Dargestellte in leicht verständlicher Form zusammen. Superstruktur der DNA Die menschliche DNA einer diploiden Zelle besteht aus ungefähr 6 x 10 9 Basenpaaren, verteilt auf 46 Chromosomen. Jeder Zellkern enthält somit 46 DNA-Moleküle unterschiedlicher Grösse (vgl. DNA in Zellorganellen wie Mitochondrien und Chloroplasten). Würde man die DNA in den 46 Chromosomen zu einer einzigen Doppelhelix zusammenfügen, käme man auf eine Länge von 2 Metern DNA pro Zelle! Es ist einleuchtend, dass die DNA Strukturen annehmen muss, die es erlauben, sie in den Zellkern zu packen und sie vor Scherkräften zu schützen, die die nur 2 nm Dicke Doppelhelix in Stücke reissen könnten. Aus diesem Grund binden bestimmte Proteine an die DNA und verformen diese zu stabilen Superstrukturen. Solche DNA-Proteinkomplexe nennt man Chromatin. Bei Zellteilungen Mitosen und Meiosen -, müssen sich die Chromosomen zu Mitosechromosomen maximal verdichten (kondensieren), damit sie überhaupt auf die Tochterzellen verteilt werden können. Betrachten wir also vorerst die sogenannten Interphasenchromosomen. Die an DNA gebundenen Proteine machen einen beträchtlichen Teil des Chromatins aus. Tatsächlich besteht Chromatin etwa zur Hälfte aus Proteinen, welche noch in Histone und Nicht- Histon-Proteine unterteilt werden können. Histone sind kleine, basische Eiweisse, die nur in Eukaryonten vorkommen. Mit ihrem hohen Anteil an positiv geladenen Aminosäuren wie Arginin und Lysin können sie relativ unspezifisch an die DNA binden und die negativen Ladungen der Phosphatgruppen des "DNA-Rückgrats" kompensieren. Aufgabe: Überlegen Sie sich, welche Auswirkungen es auf die Stabilität der DNA hätte, wenn die negativen Ladungen der Helix nicht aufgehoben würden. Lösung: S. 13 8

9 Es gibt insgesamt fünf verschiedene Klassen von Histonen: H1, H2A, H2B, H3 und H4. Gewisse eukaryontische Zellen - wie z.b. die Erythrocyten des Huhns - haben noch einen weiteren Typ, das Histon H5, welches als Variante von H1 angesehen wird. Je zwei Moleküle H2A, H2B, H3 und H4 verbinden sich zu einem Histon-Octamer. Die DNA-Doppelhelix wickelt sich nun in Linkswindungen um dieses Octamer wie ein Faden um eine Spule. Die dadurch entstehende Struktur ist das Nucleosom. Weitere Angaben: Core-Partikel Chromatosom Nukleosom Core-Partikel: Die Doppelhelix wickelt sich 1 3/4-mal um das Histon-Oktamer. Dies entspricht 146 Basenpaaren (bp) DNA. Chromatosom: Es enthält zwei volle Windungen DNA (166 bp DNA).Daran bindet zusätzlich noch das Histon H1 (vertikaler Zylinder, rechts). Nukleosom: Es besteht ebenfalls aus zwei Windungen DNA, dem Histon-Octamer und H1, hat aber noch sog. Linker-DNA von etwa 30 bp, welche benachbarte Nukleosomen miteinander verbindet. Ein Nukleosom enthält also etwa 200 bp DNA. Behandelt man Chromatin mit einer stark hypotonen Lösung, so lassen sich die Chromosomen als Nukleosomenfäden im Elektronenmikroskop darstellen. Sie gleichen einer Perlenkette: Die nächsthöhere strukturelle Einheit des Chromatins ist das Solenoid. Für die Ausbildung des Solenoids ist das Histon H1 essentiell: es verbindet benachbarte Nukleosomen zu einer 30 nm dicken Chromatinspirale. Wie sich dieser Prozess genau vollzieht, ist aber noch weitgehend unklar. Folgendes EM-Bild veranschaulicht die dichte Packung der Nukleosomen: 9

10 Die Solenoid-Faser wird gelegentlich von nicht-histon-proteinen in Segmente unterteilt, wie folgendes Modell zeigt: Diese Proteine binden meist sequenzspezifisch an die DNA und stellen zum Teil Gen- Regulationsproteine (z.b. Transkriptionsfaktoren) dar, andere helfen bei der Initiation der DNA- Replikation. Eine weitere Gruppe von Proteinen organisiert das Solenoid in Schleifen, welche von der Hauptachse des Chromosoms abstehen. Ohne die Ausbildung von Schleifen, als lineares Solenoid also, würde ein durchschnittlich grosses Chromosom den Zellkern als 30-nm-Faser von 1 mm Länge etwa hundertmal durchmessen. Auch hier sind die Details der Faltung noch unbekannt und Gegenstand intensiver Forschung. Unten ein Schema, das das Prinzip der Faltungen wiedergibt: Hinweis: D. Hewish und L. Burgoyne waren unter den ersten, welche sich mit der Strukturaufklärung des Chromatins beschäftigten. Lesen Sie dazu das Dokument "Hewish & Burgoyne, 1973" am Geschichtsposten: Dokument G

11 Sowohl in Eukaryonten wie in Prokaryonten gibt es Enzyme, die Topoisomerasen, die unter ATP-Verbrauch einen oder beide DNA-Stränge auftrennen, durch Rotation um die Helixachse die Windungszahl pro Längeneinheit ändern und dann die freien Enden wieder verknüpfen (ligieren). Die Topoisomerase I spaltet dabei nur einen, die Topoisomerase II beide DNA-Stränge. Nimmt die Windungszahl pro Längeneinheit zu, spricht man von positivem Supercoiling, nimmt sie ab, von negativem Supercoiling. Diese Konformationsänderung setzt die DNA unter Torsionsspannung. Hat die DNA ein freies Ende, so kann sie sich wieder entspannen, indem sie um ihre Achse rotiert. Sind dagegen beide Enden fixiert, wie bei der Ring-DNA der Prokaryonten oder bei Chromatin-Schleifen, kann die DNA die Überspannung nur durch Ausbildung einer superhelicalen Schleife kompensieren (zwei fixe Enden können nicht frei rotieren). Bei dieser DNA-Superhelix ist die DNA zusätzlich zu den Doppelhelixwindungen umeinander verdrillt: Sie können sich die Entstehung dieser Konformation am besten vorstellen, wenn sie an ein spiraliges Telefonkabel denken, welches Sie aus einem gedehnten in einen entspannten Zustand führen. Hinweis: Gute Dienste leistet ein Schnurmodell aus zwei umeinander verdrillten Fäden, an dem Sie die Auswirkungen von positivem und negativem Supercoiling studieren können. Die Schnur und eine Anleitung finden Sie beim Posten. Topoisomerasen benötigen für die Rückführung (Relaxation) in den Normalzustand kein ATP; die Energie steckt nämlich in der Supercoil-Konformation selbst: 11

12 Was ist denn der Zweck dieser Superstrukturen? Negatives Supercoiling erleichtert wahrscheinlich Prozesse wie Replikation oder Transkription, weil die "unterwundene" DNA den Zugang bestimmter Proteine zu Steuersequenzen erleichtert. Quellennachweis Die Texte und Abbildungen des vorliegenden Scripts entsprechen den Seitenangaben aus folgenden Werken: Bruce Alberts et al.: Molekularbiologie der Zelle", VCH, 2. Auflage, p. 57, 62-63, p , p. 571, 577, , p Walther Traut: Chromosomen - klassische und molekulare Cytokinetik", Springer-Lehrbuch, p Hinweis: In der Lese-Ecke stehen Ihnen Lehrbücher zum vertieften Studium zur Verfügung 12

13 Lösungen Versuchen Sie aus folgender DNA-Sequenz den komplementären Strang zu finden: 5'-AATCAGCGATCGCTG-3' 3 -TTAGTCGCTAGCGAC-5 Der komplementäre Strang hat also die Basensequenz 5'-CAGCGATCGCTGATT-3' - Sequenzen werden in 5'-> 3'-Richtung hingeschrieben! Überlegen Sie sich, welche Auswirkungen es auf die Stabilität der DNA hätte, wenn die negativen Ladungen der Helix nicht aufgehoben würden. Die negativen Ladungen würden sich gegenseitig abstossen und die Doppelhelix destabilisieren. Uebungsaufgaben mit Lösungen finden Sie in der Internetversion des Ateliers! Hinweis: Das Repetitorium Molekularbiologie definiert den Stoff, welcher in den Prüfungen verlangt wird. Wegen seiner Kürze eignet es sich allerdings nicht als primäre Informationsquelle! 13