Biochemie Tutorium 8. Nukleinsäuren, DNA &Replikation

Transkript

1 Biochemie Tutorium 8 Nukleinsäuren, DNA &Replikation

2 IMPP-Gegenstandskatalog 3 Genetik 3.1 Nukleinsäuren Molekulare Struktur, Konformationen und Funktionen der Desoxyribonukleinsäure (DNA); Exon, Intron Molekulare Strukturen und Funktionen der Ribonukleinsäure (RNA) Genetischer Code 3.2 Umsetzung genetischer Information Transkription der DNA Prozessieren der RNA Translation Regulation der Proteinbiosynthese 3.3 Weitergabe und Verteilung genetischer Information Replikation der DNA Zellzyklus, Mitose, Meiose Meiotische Systeme, Kernphasenwechsel, Generationswechsel Plasmatische Vererbung Parasexuelle (parameiotische) Systeme, Phagen, Plasmide, Resistenzfaktoren 3.4 Veränderungen der genetischen Information Somatische Mutationen, Mutationen der Keimbahn Mutationstypen, Genom-, Chromosomen- und Punktmutationen, Ames-Test Mutagene Faktoren und transponierbare genetische Elemente Umordnung der Gene (Anikörperbildung) 3.5 Grundlagen der Molekularbiologie Techniken der Molekularbiologie Klonierung und Überexpression von Genen

3 Nukleinsäuren Die Nukleinsäuren sind Träger der Erbinformation. Man unterscheidet DNA und RNA. Die Gesamtmenge der DNA einer Zelle enthält die vollständige genetische Information und wird als Genom bezeichnet. Ein für ein bestimmtes RNA-Molekül codierender Abschnitt der DNA wird als Gen bezeichnet. In der Zelle gibt es verschiedene Arten von RNA.

4 Bausteine der Nukleinsäuren Nukleinsäuren bestehen aus: Heterozyklischen Basen Pentosen Phosphorsäure

5 Nukleobasen Pyrimidinbasen Uracil nur bei RNA Thymin nur bei DNA

6 Purinbasen

7 Pentosen Nach Art der Zucker Einteilung in Ribonukleinsäure (RNA) und Desoxyribonukleinsäure (DNA) β-d-ribofuranose RNA-Baustein β-d-desoxyribofuranose DNA-Baustein

8 Nomenklatur Nukleoside Den Pyrimidinbasen wird die Endung idin angehängt Den Purinbasen wird die Endung osin angehängt Beispiele: Adenin + Ribose = Adenosin Thymin + Desoxyribose = Desoxythymidin Nukleotide Den Pyrimidin-Nukleotide erhalten die Endung idylat Die Purin-Nukleotide erhalten die Endung -ylat

9 Nukleotidaufbau Pentose und Nukleobase sind über eine glykosidische Bindung verknüpft (C1-N) Das Nukleosid bindet am C5 der Pentose einen Phosphorsäurerest über eine Ester- Bindung

10 Desoxyribonucleotide

11 Ribonukleotide

12 Aufbau Nukleinsäuren Nukleinsäuren sind Polynukleotide Primärstruktur = Reihenfolge der Nukleotide Verknüpfung der Nukleotide: Zucker der Nukleotide über Phosphorsäurediesterbindungen miteinander verknüpft ( Backbone, führt zu negativer Ladung der DNA) Basen stehen frei Jeder Einzelstrang besitzt zwei Enden: 3 -Hydroxyl-Ende: Freie Hydroxygruppe an der Ribose 5 -Phosphat-Ende: freie Phosphatgruppe am C5 der Ribose DNA-Polymerasen können neue Nukleotide nur an die OH-Gruppe am 3'-Ende anfügen, nicht aber am 5'- Ende. Der Einzelstrang wächst also immer von 5' nach 3'

13 Desoxyribonukleinsäure (DNA) Makromolekül aus 2 Polynukleotidketten Doppelstrang Basen liegen sich paarweise gegenüber und sind durch Wasserstoffbrückenbindungen verknüpft Es gibt drei bekannte Konformationen der DNA

14 Basenpaarung Je zwei Basen verbinden sich über Wasserstoffbindungen miteinander Basenpaarung: es stehen sich immer je eine Purin- und eine Pyrimidin-Base, entweder A-T oder C-G gegenüber Adenin verbindet sich mit Thymin Cytosin verbindet sich mit Guanin

15 zwischen einem A-T- (oder T-A-)-Basenpaar: 2 WBB zwischen einem C-G- (oder G-C-)-Basenpaar: 3 WBB Bindung zwischen G und C (C und G) stärker als zwischen A und T (T und A)

16 Komplementäres Prinzip Aufgrund der Basenpaarbildung ist die Basensequenz der einen Kette, durch die andere Kette vorgeschrieben Prinzip der komplementären Basenpaarung

17 Räumliche Struktur der DNA Das DNA-Molekül kann in verschiedenen Konformationen vorliegen: A-Form B-Form Z-Form Die häufigste Konformation ist die B-Form

18 B-Form Die DNA liegt meist in Form einer rechtsgängigen schraubenartigen Doppelhelix vor, dabei winden sich beide Einzelstränge um eine imaginäre gemeinsame Achse. Beide Einzelstränge verlaufen in entgegengesetzter Richtung. Die Doppelhelix wird durch die Wasserstoffbrücken stabilisiert. In die B-Form sind Wassermoleküle eingelagert

19 B-Form Die schraubenförmige Doppelhelix bildet unterschiedlich große senkrechte Abstände zwischen den beiden Einzelsträngen aus: Große Furchen Kleine Furchen

20 A-Form Ebenfalls rechtsgängige Schraube Kürzere Windungslänge als bei B-Form Unterschied der Furchengröße stärker ausgeprägt als bei der B-Form Basen liegen gewinkelt zur Schraubenachse B-Form ist Konformation, die im Zellkern vorliegt, A-Form während der Transkription

21 Z-Form Basen sind nicht nach innen, sondern nach außen orientiert. Die Z-Form ist linksgängig Vor allem in G-C-reichen Sequenzen Für chemischen Angriffe leichter zugänglich Orte bevorzugter Mutation ( hot spots ) Karzninogene, wie z.b. Aflatoxine greifen das Guanin in DNA-Abschnitten an, die eine Z- Konformation aufweist.

22 Konformationen A-Form B-Form Z-Form

23 Doppelhelix

24 Organisation Würde man sich die menschliche DNA als lineares Makromolekül vorstellen, so hätte sie eine Länge von ca. 1,8 m. Die menschliche DNA liegt mit Ausnahme der mitochondrialen DNA im Zellkern. Damit die DNA in den Zellkern passt, liegt sie in kondensierter Form als sog. Chromatin vor. Die DNA ist mit den sog. Histonproteinen assoziiert. deutliche Verringerung des Volumens

25 Durch Assoziation der DNA mit Histonen (basische Proteine) entstehen sog. Nucleosomen. Die Nucleosomen sind perlenartig zu einer Faser aufgewickelt, die in Form von Schleifen unter Beteiligung von Nicht-Histonproteinen gefaltet ist Chromatin In eukaryoten Zellen ist das Chromatin in Form von Chromosomen angeordnet.

26

27 Chromosomen Der somatische Chromosomensatz ist diploid (d.h. er enthält zwei Kopien eines Chromosoms je ein väterliches und ein mütterliches). Er besteht somit aus 46 Chromosomen. Gameten enthalten nur 23 Chromosomen, der Chromosomensatz ist haploid.

28 Telomer

29 Telomer Chromosomenende mehrere tausend Wiederholungen einer nicht codierenden Sequenz aus Nucleotiden (TTAGGG) verhindern das Verkleben der Chromosomenenden Problem: verkürzt sich mit jeder Replikation

30 Telomer Ca. 40 Zellteilungen, bis das Telomer aufgebraucht ist. Danach ist die Zelle nicht mehr in der Lage sich zu teilen Einleitung der Apoptose Dies gilt allerdings nur für somatische Zellen.

31 Telomerase Lösung: Das Enzym Telomerase kann die Telomere wieder verlängern Benutzt interne RNA-Sequenzen zur Synthese von Telomeren Besonders bei Embryonalzellen, bestimmte Stammzellen und Tumorzellen nachweisbar

32 Telomerase

33 Prokaryotische DNA In prokaryotischen Zellen liegt die doppelsträngige DNA meist nicht als linearer Strang, sondern als zirkuläres Molekül vor. (5 - Ende und 3 -Ende verbinden sich über Phophorsäurediester-Bindung) Abhängig von der Sequenzlänge werden Bakterienchromosom und Plasmide unterschieden.

34 Die prokaryotische DNA ist nicht in einem Zellkern lokalisiert. Die Plasmide und Bakterienchromosomen liegen frei im Plasma. Um Platz einzusparen wird die prokaryotische DNA zu sog. Supercoils aufgewickelt.

35

36 Replikation (= Reduplikation) Als Träger der genetischen Information muss bei jeder Zellteilung eine genaue Kopie der DNA erstellt werden, sodass beide Tochterzellen jeweils wieder auf den gleichen genetischen Informationspool zurückgreifen können. Der Vorgang der Verdopplung wird als Replikation bezeichnet. Die Replikation findet während der sog. S-Phase des Zellzyklus statt.

37 Eukaryoten vs. Prokaryoten Die DNA der EUKARYOTEN: größer(wenige Milliarden Basenpaare bei Eukaryoten gegenüber einigen Millionen bei Prokaryoten) linarer Form (Prokaryoten ringförmig) stärker verpackt die DNA-bindenden Proteine haben stärkeren Einfluss mehrere Origins der Initation der Eukaryotischen Replikation geringere Geschwindigkeit der Replikation Replikationszeitbeträgt mehrere Stunden (Prokaryoten wenige Minuten) Die Ende der Eukaryotischen Chromosomen(Telomeren)werden verkürzert. (lineare Form!) Der Prozeß läuft im Zellkern (bei Prokaryonten in Cytoplasma). Bei den beteiligten Proteinen handelt es sich in der Regel um solche mit gleicher Funktionalität, aber unterschiedlichem Aufbau.

38 Semikonservatives Prinzip Bei der Replikation der DNA erfolgt eine lokale Aufspaltung des DNA-Doppelstrangs in beide Einzelstränge. Jeder Einzelstrang dient anschließend als Matrize für die Synthese eines neuen Strangs mit entsprechend komplementärer Basenpaarung. D.h. am Ende eines Replikationszyklus sind zwei neue Doppelstränge entstanden, die je einen neuen und einen alten Einzelstrang enthalten.

39 Ablauf der Replikation Die Replikation kann in der Stadien unterteilt werden: Initiation Elongation Termination Die gleiche Einteilung wird auch für Transkription und Translation verwendet.

40 Initiation Während der Initiation muss die Startstelle der Replikation (origin) von entsprechenden Proteinkomplexen erkannt werden. Anschließend müssen die DNA-Doppelstränge lokal entwunden und in die beiden Einzelstränge getrennt werden.

41 Helicase Die lokale Entwindung der DNA ist ein ATP-abhängiger, enzymkatalysierter Prozess. Die verantwortlichen Enzyme werden als Helicasen bezeichnet. Die Helicasen brechen die Wasserstoffbrücken zwischen den Basenpaaren unter ATP-Verbrauch. Beide Stränge werden am Replikationsursprung (origin) zu einer Replikationsblase geöffnet, die an jedem Ende eine Replikationsblase besitzen. Die Reassoziation der beiden getrennten Einzestränge zum Doppelstrang wird durch Anlagerung sog. Einzelstrang-Bindungsproteine verhindert.

42

43 Topoisomerase Eine Folge der lokalen Entwindung der DNA ist die zunehmende Verdrillung des gesamten DNA- Doppelstrangs, welche zur Ausbildung einer sog. Supercoil führen würde, die zur topologischen Hemmung der Replikation führt. In einer ATP-abhängigen Reaktion wird durch die Topoisomerase die Superspiralisierung dadurch behoben, dass einer der beiden Einzelstränge durchtrennt, die DNA entspannt und anschließend wieder verknüpft wird. Hinter der Replikationsgabel erzeugt die Topoisomerase wieder Spiralisierung durch eine analoge Reaktion.

44

45 Topoisomerasen sind wichtige Zielstrukturen für Azneimittel. Bakterielle Topoisomerase wird auch als Gyrase bezeichnet: Hemmung durch bestimmte Arzneistoffe (Gyrasehemmer) Ciprofloxacin, Novobiocin Humane Topoisomerase wird durch bestimmte Zytostatica gehemmt. (Anwendung bei Tumortherapie) Camptothecin

46 Elongation Die für die Elongation verantwortlichen Enzyme werden als Polymerasen bezeichnet. Der Mechanismus der Kettenverlängerung beruht auf einem nucleophilen Angriff der freien 3 -OH- Gruppe des zu verlängernden DNA-Strangs an die Pyrophosphatbindung zwischen dem α- und β- Phosphat des anzuknüpfenden Desoxyribonukleotids. Die Verlängerung eines DNA-Strangs kann nur vom 5 -Ende zum 3 -Ende hin erfolgen!

47 Substrate für die DNA-Polymerasen Als Substrate für die DNA-Polymerasen dienen: Purinnukleotide datp dgtp Pyridinnukleotide dctp dttp

48 Alle DNA-Polymerasen benötigen einen als Matrize bezeichneten DNA-Einzelstrang, dessen Basensequenz die Reihenfolge der Desoyribonukleotide für die Verlängerung bestimmt. Dadurch wird gewährleistet, dass der neusynthetisierte Strang komplementär ist.

49 Primase DNA-Polymerasen sind nicht in der Lage, ein freies 3 -OH-Ende zu synthetisieren. Sie benötigen zum Start der Kettenverlängerung einen sogenannten Primer (kurzes, zu Matrize komplementäres RNA-Oligonukleotid mit freiem 3 -OH-Ende), an den neue Desoxyribonukleotide angehängt werden können. Primer werden durch sog. Primasen gebildet. Primasen sind RNA-Polymerasen, die einen zu einem DNA-Einzelstrang komplementären RNA- Strang synthetisieren können.

50 Bei den Prokaryoten ist die Primase ein eigenständiges Enzym, bei den Prokaryoten eine Teilaktivität der DNA-Polymerase α

51 Leitstrang und Folgestrang Durch die antiparallele Orientierung der beiden Einzelstränge und die Eigenschaft der Polymerasen, DNA-Stränge nur in 5-3 -Richtung zu verlängern, kann die Replikation nur in einem Strang kontinuierlich verlaufen. Dieser Strang wird auch als Leitstrang oder Führungsstrang bezeichnet. Der andere Strang, bei dem die Elongation diskontinuierlich verläuft, ist der sog. verzögerte oder Folgestrang.

52 Elongation am Leitstrang Die Richtung der DNA-Polymerisierung entspricht nur am Leitstrang der Wanderungsrichtung der Replikationsgabel. Dieser Strang wird, nachdem einmal ein Primermolekül synthetisiert wurde, kontinuierlich verlängert.

53 Elongation am Folgestrang Bei dem Folgestrang verläuft die Polymerisationsrichtung entgegengesetzt zur Wanderungsrichtung der Replikationsgabel. Am Folgestrang erfolgt die Synthese diskontinuierlich in Stücken von einigen tausend Basen. Diese Zwischenprodukte werden als Okazaki- Fragmente bezeichnet.

54 Okazaki-Fragmente Sie entstehen dadurch, dass nach der Synthese eines derartigen Fragmentes jeweils wieder an der Replikationsgabel ein neuer Primer synthetisiert wird, der anschließend solange verlängert wird, bis er an das vorher synthetisierte Okazaki-Fragment stößt.

55 Um aus den Okazaki-Fragmenten einen kontinuierlichen DNA-Strang zu bilden, müssen zunächst durch eine 5-3 -Exonukleaseaktivität die RNA-Primer entfernt werden. Anschließend werden die entstandenen Lücken durch die Polymerase aufgefüllt. Die reinen DNA-Fragmente werden anschließend durch eine Ligase zu einem kontinuierlichen DNA- Strang verknüpft.

56

57 Termination Die Termination der Replikation findet statt, sobald zwei Replikationsblasen ineinander übergehen. Der Mechanismus der Termination ist noch weitgehend unbekannt.