Robin Martin. Elektrophorese. von Nucleinsäuren

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1 Robin Martin Elektrophorese von Nucleinsäuren

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3 Abkürzungen 11 Vorwort 13 Danksagung 15 I. Grundprinzipien und Methoden 1. Einleitung: Verschiedene Arten und Formen von Nucleinsäure Überblick Gelelektrophorese und die Eigenschaften der Nucleinsäuren Vielfalt und Formen von Nucleinsäuren 23 Literatur Theorie der Nucleinsäuregelelektrophorese Das Verhalten von Nucleinsäuren i n Flüssigkeiten und Gelen Elektrischer Strom und Pufferlösungen Nucleinsäuren in Flüssigkeiten Nucleinsäuren in Gelen Das Verhalten von Nucleinsäuren im Ge l bei einem konstanten elektrischen Feld Siebwanderung nach Ogston (Ogston sieving) Schlängelbewegung (reptation) Wanderung als starre Stäbchen Bewegungen von Nucleinsäuren im Ge l bei elektrischen Pulsfeldern 42 Literatur 44

4 3. Gelelektrophorese nativer un d denaturierter Nucleinsäuren Die Kontrolle der Basenpaarung Physikalische und chemische Denaturierungsmitte l für die Nucleinsäuregelelektrophorese Temperatur Alkalische Bedingungen Methylquecksilberhydroxid, Glyoxal und Formaldehyd : Denaturierungsmittel für RNA in Agarosegelen Harnstoff und Formamid Bindung von Proteinen an Nucleinsäure n in der Gelelektrophorese 5 1 Literatur Eine Frage des Formats : Horizontal oder vertikal, Agarose oder Polyacrylamid? Kammern für horizontale und vertikale Gele Kammern für horizontale Agarosegele Kammern für vertikale Polyacrylamidgele Netzgeräte für die Nucleinsäuregelelektrophorese Agarosegelmedien für die Nucleinsäuregelelektrophorese Agarosederivate Agarose mit einem niedrigen Schmelzpunkt Agarose mit einer höheren Festigkeit Kleinporige Agarose VisigelTM Fertige Agarosegele Polyacrylamidmedien für die Nucleinsäuregelelektrophorese Polyacrylamidderivate Fertige Polyacrylamidgele Keilförmige Gele Die Toxizität de r Polyacrylamidgelkomponenten 73 Literatur 74

5 5. Nachweis von Nucleinsäuren im Anschluß an eine elektrophoretische Auftrennung Überblick Prinzip des Nucleinsäurenachweises Bindung von Fluoreszenzfarbstoffen Markierung mit radioaktiven Nucleotiden Markierung mit fluoreszierenden Nucleotiden Markierung von Nucleinsäure n mit spezifischen Proteinen Indirekte DNA-Protein-Kopplung Direkte DNA-Protein-Kopplung Konventionelle Färbung In situ-nachweis und Nachweis nach Transfer auf Membranen Zusammenfassung der Nachweismethoden für Nucleinsäuren 98 Literatur 9 9 II. Techniken und Beispiele aus der Wissenschaft 6. Leitfaden für Durchführung und Anwendungen Welches Vorgehen eignet sich für welches Molekül? Strategische Überlegungen : Wie vermeidet man elementare Fehler? Nichtdenaturierende Agarosegelelektrophorese Puffer für nichtdenaturierende Agarosegele Das Auflösungsvermögen der Agarose bei Veränderungen der Gelkonzentration und der Feldstärke Längenbestimmung bei unbekannten Fragmente n mit Hilfe halblogarithmischer Darstellung 114

6 7.4 Lösung eines problematischen Falls : Auftrennung der und 4973 bp-banden aus dem Hin diii/eco RI - Restriktionsverdau der DNA des Phagen A Alternativen zur Ethidiumbromidfärbung Passive Diffusion : Kann man ein Agarosegel übe r Nacht stehen lassen, bevor man es photographiert? Wie kann man unbekannte Mengen abschätzen? Wieviel soll auf ein Gel aufgetragen werden? Abschätzen unbekannter Mengen Wieviel soll auf ein Gel aufgetragen werden? DNA-Konformation und Beweglichkeit der Moleküle in Agarosegelen Erhitzen von '.-DNA-Markern Eine Bemerkung zum Photographieren Aufzeichnung der Markerpositionen bei der Übertragung der DNA auf eine Membran Überblick über die wissenschaftliche n Anwendungsmöglichkeiten Wissenschaftliches Anwendungsbeispiel: Nichtdenaturie - rende Agarosegelelektrophorese beim Southern Blot Hintergrund Das Vorgehen im einzelnen Interpretation 134 Literatur Denaturierende Agarosegelelektrophorese Wissenschaftliches Anwendungsbeispiel : Denaturierende Gelelektrophorese einzelsträngige r RNA-Moleküle beim Northern Blot Hintergrund Das Vorgehen im einzelnen Interpretation 140 Literatur Pulsfeldgelelektrophorese Prinzip der Pulsfeldtechnologie Die Geometrie der Pulsfeldelektrode Präparation der Proben für Pulsfeldgele 145

7 9.4 Wissenschaftliches Anwendungsbeispiel : Pulsfeldgelelektrophorese für die Kartierung von Genomen Hintergrund Das Vorgehen im einzelnen Interpretation 150 Literatur Nichtdenaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese Überblick Wissenschaftliches Anwendungsbeispiel : Hochauflösende Trennung doppelsträngige r PCR-Produkte Hintergrund Das Vorgehen im einzelnen Interpretation Konformationspolymorphismen bei Einzel- und Doppelsträngen : SSCP und DSCP Prinzip des Mutationsnachweises aufgrund vo n gelelektrophoretischzu unterscheidende n Konformationspolymorphismen Wissenschaftliches Anwendungsbeispiel : Nichtdenaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese bei der SSCP-Analyse zu m Nachweis von Mutationen Bandshiftanalysen Prinzip der Bandshiftanalysen Wissenschaftliches Anwendungsbeispiel : Bandshiftanalyse zur Untersuchung des MUC1-Promotors 172 Literatur Denaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese Überblick DNA-Sequenzierung Prinzipien der DNA-Sequenzierung Wissenschaftliches Anwendungsbeispiel : Verwendung von dgtp als Basenanalogon, um Kompressionsartefakte in eine m Sequenzgel zu vermeiden 185

8 11.3 DNase I-Footprintanalyse Prinzip der DNase I-Footprintanalyse Wissenschaftliches Anwendungsbeispiel : DNase I-Footprintanalyse zur Untersuchung des MUC1-Promotors RNase-Protection-Assay Prinzip des RNase-Protection-Assays Wissenschaftliches Anwendungsbeispiel : RNase - Protection-Assays zur Identifizierung eines Transkriptionsstartpunktes S1-Nuclease-Protection-Assay Prinzip von S1-Nuclease-Protection-Assays Wissenschaftliches Anwendungsbeispiel : S1-Nuclease-Protection-Assay Primer-Extension-Assay Prinzip des Primer-Extension-Assays Wissenschaftliches Anwendungsbeispiel : Primer-Extension-Assay 206 Literatur 21 0 Anhang A : Glossar 213 Anhang B : Bezugsquellen 21 9 Index 221