I. EINLEITUNG 1. C Zielsetzung Funktionelle Charakterisierung der Polymerase des Hepatitis-C-Virus 27

Größe: px

Ab Seite anzeigen:

Download "I. EINLEITUNG 1. C Zielsetzung Funktionelle Charakterisierung der Polymerase des Hepatitis-C-Virus 27"

Jasper Friedrich
vor 7 Jahren
Abrufe

1 I. EINLEITUNG 1 A Das Hepatitis-C-Virus (HCV) 1 1. Klassifizierung und Aufbau des Virus 1 2. Weltweite Verbreitung 3 3. Der Lebenszyklus 4 4. Die Übertragung von HCV und Pathogenese der Virusinfektion 6 5. Therapie 7 6. Die virale Polymerase Struktur der HCV-Polymerase Biochemische Charakterisierung der HCV-Polymerase Oligomerisierungsverhalten RNA-Bindung Der Initiationsmechanismus Self-priming Mechanismus P/t-abhängige Synthese De novo Synthese (primerunabhängige Synthese) 14 B DNA-abhängige DNA-Polymerasen Charakteristika und Klassifizierung Substratspezifität von DNA-Polymerasen Die HIV-1 Reverse Transkriptase Struktur der HIV-1 Reversen Transkriptase Mechanismus der Reversen Transkriptase katalysierten Polymerasereaktion Das Klenow Fragment Struktur des Klenow Fragments Mechanismus der durch das KF katalysierten Polymerasereaktion Die Dbh-bypass-Polymerase Die Y Familie der DNA-Polymerasen Die DinB Subfamilie Die Struktur der Dbh-bypass-Polymerase Funktionelle Aspekte der Dbh-bypass-Polymerase 27 C Zielsetzung Funktionelle Charakterisierung der Polymerase des Hepatitis-C-Virus 27

2 2. Untersuchungen zur Substratspezifität von DNA-Polymerasen 28 II. MATERIAL Chemikalien Modifizierte und radioaktiv markierte Nukleotide Proteine und Standards Nährmedien für die Kultivierung von Bakterien Bakterienstämme und Plasmide Oligonukleotide RNA-Oligonukleotide DNA-Primer/Template-Substrate Geräte und Materialien Säulen und Säulenmaterial Puffer 36 III. METHODEN 37 A Molekularbiologische Methoden Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren in Lösungen Reinigung von DNA bzw. RNA mittels Phenol-/Chloroform-Extraktion Isopropanolfällung von Nukleinsäuren Restriktionshydrolyse von DNA Isolierung von DNA aus Agarosegelen Ligation von Plasmid-DNA Herstellung elektrokompetenter Escherichia coli-zellen (E. coli) Transformation von E. coli durch Elektroporation von Plasmid-DNA Glyzerinkulturen von Bakterien Plasmidisolierung aus Bakterien im kleinen Maßstab Plasmidisolierung aus Bakterien im großen Maßstab DNA-Sequenzierung 41 B Proteinbiochemische Methoden Denaturierende SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese SDS-(PAGE) Proteinexpression Zellaufschluss durch Ultraschall Proteinkonzentrationsbestimmung Konzentrationsbestimmung durch Absorptionsbestimmung bei 280 nm 45

3 4.2 Konzentrationsbestimmung nach Bradford Konzentrationsbestimmung nach Ehresmann Aufkonzentrierung und Umpuffern von Proteinlösungen Reinigung von Fragmenten der HCV-Polymerase (NS5B) Ni-NTA-Säule Poly(U)-Säule Reinigung der Dbh-Polymerase Hitzedenaturierung HiTrap SP Säule Gelfiltration Reinigung der HIV-1 Reversen Transkriptase Erste Ammoniumsulfatfällung DNA/RNA-Fällung DEAE-Säule Heparin-Säule Zweite Ammoniumsulfatfällung Gelfiltration Reinigung des Klenow Fragments der E. coli DNA-Polymerase Ni-NTA-Säule Gelfiltration Nachweis von freien Cysteinen mit Ellmanns Reagenz Farbstoffkopplung am freien Cysteinrest der Dbh-Polymerase MALDI-TOF Massenspektroskopie (MS) RNAse-Test Test auf Terminale Transferase (TNTase) Aktivität 57 C Nukleinsäuren Denaturierende Polyacrylamid-Harnstoff Gelelektrophorese (PAGE) Präparative Polyacrylamid-Harnstoff Gelelektrophorese (PAGE) Analytische Polyacrylamid-Harnstoff Gelelektrophorese (PAGE) Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) Radioaktive Markierung von DNA bzw. RNA am 5 -Ende durch die T4 Polynukleotid Kinase (PNK) Endmarkierung von Oligonukleotiden Markierung eines Dinukleotid-Primers Oxidation der 3 -Hydroxylenden von Oligonukleotiden 61

4 5. Kopplung von Mansylchlorid an modifizierte Oligonukleotide Reversed Phase HPLC-Reinigung Herstellung von DNA/DNA- und RNA/RNA-Primer/Template 63 D Enzymkinetische Methoden Gleichgewichts-Fluoreszenzspektroskopie Transiente Fluoreszenzmessungen (Stopped-Flow) Transiente Fluoreszenzmessungen durch Relaxation nach einem Drucksprung Quench-Flow Messungen Charakterisierung sehr schneller Einbaukinetiken Charakterisierung langsamer Einbaukinetiken Auswertung des zeitabhängigen Nukleotideinbaus Ermittlung der Affinität der Nukleotide zur Polymerase Auswertung des konzentrationsabhängigen Nukleotideinbaus Untersuchungen zum Nukleotideinbau durch die HCV-Polymerase Nukleotid-Einbaustudien mit Hilfe radioaktiv markierter Primer Nukleotid-Einbaustudien mit Hilfe radioaktiv markierter Nukleotide Filterbindungsassays Analytische Gelfiltration Gelshift-Analysen Untersuchung von Oligomerisierungszuständen mit der dynamischen Lichtstreuung (DLS) Bestimmung von Polymeraseaktivitäten Standard Polymeraseassay zur Abschätzung der Aktivität von HIV-1 RT Standard Polymeraseassay zur Abschätzung der Aktivität von HCV-Polymerase 78 IV. ERGEBNISSE 79 A Biochemische Charakterisierung der Hepatitis-C-Virus Polymerase Klonierung und Expression von NS5B 21 und NS5B Präparation von NS5B 21 und NS5B Biochemische Charakterisierung von NS5B 21 und NS5B Standardpolymerasetest Test der Präparation auf RNase-Verunreinigungen Test der Präparation auf Terminale Transferase Verunreinigungen Optimierung der Pufferbedingungen Optimierung der Reaktionstemperatur 87

5 3.6 Bestimmung der Anzahl der Oberflächencysteine durch Ellmann s Reagenz Oligomerisierungsverhalten von NS5B 21 und NS5B Untersuchung des Oligomerisierungsverhaltens mittels analytischer GF Untersuchung des Oligomerisierungsverhaltens durch native PAGE Untersuchung des Oligomerisierungsverhaltens durch DLS Charakterisierung der RNA-Bindung durch NS5B 21 und NS5B Affinität verschiedener Nukleinsäuresubstrate zu NS5B 21 und NS5B Bestimmung der Affinität zu dsrna Bestimmung der Affinität zu ssrna Kinetik der RNA-Bindung an die HCV-Polymerase Bestimmung der Assoziation von ssrna und HCV-Polymerase Bestimmung der Dissoziation von ssrna von der HCV-Polymerase Charakterisierung der Polymeraseaktivität von NS5B 21 und NS5B Primerabhängige Synthese De novo Synthese Primerabhängige Synthese mit einem Dinukleotidprimer Test des Konzeptes Ratenbestimmung des korrekten Einbaus von ATP während der Initiation Affinität von ATP während des korrekten Nukleotideinbaus Stabilität des Initiationskomplexes Variation der Vorinkubationszeit Vorverdünnungen in verschiedenen Puffern Verlängerung des Dinuklotidprimers in Anwesenheit verschiedener Nukleotide 114 B Untersuchung der molekularen Mechanismen der Substratspezifität von DNA-Polymerasen Präparationen der verschiedenen DNA-Polymerasen Präparation der Dbh-bypass-Polymerase Präparation des Klenow Fragments Präparation der HIV-1 RT Biochemische und kinetische Charakterisierung der Dbh-bypass-Polymerase Charakterisierung der DNA-Bindung durch die Dbh-bypass-Polymerase Kopplung von Mansylchlorid an Oligonukleotide Farbstoffkopplung am freien Cysteinrest der Dbh-Polymerase Affinität verschiedener DNA/DNA-p/t zur Dbh-Polymerase 124

6 2.1.4 Kinetik der Dbh-p/t-Assoziation Kinetik der Dbh-p/t-Dissoziation Charakterisierung des Nukleotideinbaus durch die Dbh-bypass-Polymerase Ratenbestimmung des korrekten Einbaus von T R TP Affinität von T R TP während des korrekten Nukleotideinbaus Ratenbestimmung des Fehleinbaus von T R TP Affinität von T H TP während des Fehleinbaus Bestimmung des Elementeneffekts beim korrekten Einbau von α-s-ttp Bestimmung des Elementeneffekts beim Fehleinbau von α-s-dttp Charakterisierung des Nukleotideinbaus durch das Klenow Fragment Ratenbestimmung des korrekten Einbaus von T R TP Affinität von T R TP während des korrekten Nukleotideinbaus Ratenbestimmung des Fehleinbaus von T R TP Affinität von T R TP während des Fehleinbaus Charakterisierung des Nukleotideinbaus durch die HIV-1 RT Ratenbestimmung des korrekten Einbaus von T R TP Affinität von T R TP während des korrekten Nukleotideinbaus Ratenbestimmung des Fehleinbaus von T R TP gegenüber einem Template G Affinität von T R TP während des Fehleinbaus Zusammenfassung der Ergebnisse beim Nukleotideinbau durch HIV-1 RT wt, HIV-1 RT M184V, KF - und Dbh 145 V. DISKUSSION 148 A HCV-Polymerase Terminale Transferase Aktivität Funktion der Oberflächencysteine der HCV-Polymerase Oligomerisierungsverhalten der HCV-Polymerase RNA-Bindung durch die HCV-Polymerase Initiationsmechanismen der HCV-Polymerase Primerabhängige Synthese De novo Synthese Dinukleotidprimer Template Switching Übergreifende Diskussion zu den funktionellen Aspekten der HCV-Polymerase 167

7 B Substratspezifität von DNA-Polymerasen Dbh-bypass-Polymerase HIV-1 RT Klenow Fragment Übergreifende Diskussion zu den molekularen Mechanismen der Substratspezifität von DNA-Polymerasen 177 VI. ZUSAMMENFASSUNG 181 A Funktionelle Charakterisierung der HCV-Polymerase 181 B Untersuchungen zur Substratspezifität von DNA-Polymerasen 182 VII. ANHANG 184 A Grundlagen der Kinetik Ermittlung der Dissoziationskonstanten (K d ) aus Gleichgewichts-Fluoreszenztitrationen Analyse von Verdrängungstitrationen mit dem Programm Scientist 186 B Definitionen 187 C Abkürzungsverzeichnis 187 D Literaturverzeichnis 190 VIII. DANKSAGUNG 209

Ähnliche Dokumente

VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN UND TABELLEN VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN UND TRIVIALNAMEN

INHALTSVERZEICHNIS I VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN UND TABELLEN VII VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN UND TRIVIALNAMEN XIII 1 EINLEITUNG 1 1.1 Osmoadaption halophiler Mikroorganismen 2 1.1.1 Salt-in-cytoplasm