Allgemeiner Teil... 7

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1 Inhaltsverzeichnis Allgemeiner Teil Einleitung Nanotechnologie DNA-Nanotechnologie Desoxyribonucleinsäure DNA-Nanostrukturen Nanostrukturen aus nicht-kovalent verknüpften DNA-Verzweigungselementen Nanostrukturen aus kovalent-verknüpften DNA-Verzweigungselementen Nanoskalige Funktionseinheiten als Vorstufe zu Nanorobotern Aufgabenstellung Synthesen Synthese eines C 3h -symmetrischen Trislinkers Andere C 3h -symmetrische Linkermotive Synthese des V as -Linkers Synthese des Phosphitylierungreagenzes (Bannwarth-Reagenz) Synthese des Phosphatmodifiers Synthese des C 6 -Spacer-Phosphoramidits Synthese des Thiolmodifier-Amidits Synthese von 3 -verknüpften Trisoligonucleotiden am DNA-Synthesizer Grundlagen der Oligonucleotidsynthese Das Phosphoramidit-Verfahren Synthese von Trisoligonucleotiden unter Verwendung des V as -Linkers Synthesekonzept für Trisoligonucleotide mit einem C 3h -symmetrischen Linker Reverse Oligonucleotidsynthese Untersuchung verschiedener Festphasen für die Synthese von Trisoligonucleotiden Herstellung reverser Polystyrol-Festphasen Sequenz-Design Sequenz-Design der dodekaedrischen DNA-Nanostruktur Verlängerte Trisoligonucleotide zur adressierbaren Funktionalisierung von DNA- Nanostrukturen Hybridmoleküle aus einer DNA-Sequenz und einer modularen Funktion für die adressierbare Funktionalisierung der DNA-Nanokonstrukte Synthese der (Tris-)Oligonucleotide am DNA-Synthesizer Synthese der Trisoligonucleotide Synthese der linearen Oligonucleotide Fluorescein-modifizierte lineare Oligonucleotide Thiol-modifizierte lineare Oligonucleotide und Einführung des RUBiGOLD- Labels

2 5.3 Aufreinigung und Charakterisierung der Oligonucleotide Aufbau, Charakterisierung und adressierbare Funktionalisierung einer dodekaedrischen DNA-Nanostruktur Experimentelle Bedingungen für die Hybridisierung von Nucleinsäuren Experimentelle Bedingungen für die Hybridisierung von Trisoligonucleotiden Einfluss des Temperaturprogramms auf das Self-Assembly des DNA- Dodekaeders Einfluss der Konzentration der Trisoligonucleotide auf das Self-Assembly des DNA-Dodekaeders Einfluss verschiedener Puffer auf das Self-Assembly des DNA-Dodekaeders Einfluss der Salzkonzentration auf das Self-Assembly des DNA-Dodekaeders Zusammenfassung der experimentell ermittelten Bedingungen zum Self-Assembly des DNA-Dodekaeders Nucleinsäure-Staining in der Gelelektrophorese Densitometrische Auswertung der Agarosegele DNA-Schmelzkurven Schmelzkurve des DNA-Dodekaeders Markierung des DNA-Dodekaeders mit 32 P-markierten Trisoligonucleotiden Kinasierung der Trisoligonucleotide mit T4-Polynucleotidkinase Dotierung des DNA-Dodekaeders mit 32 P-markierten Trisoligonucleotiden Zusammenfassung der Ergebnisse zur radioaktiven Markierung von Trisoligonucleotiden Enzymatischer Verdau einzelsträngiger DNA mit Mungbohnen Nuclease Ferguson-Plot Analyse Rasterkraftmikroskopische Untersuchung des DNA-Dodekaeders Elektronenmikroskopische Untersuchung des DNA-Dodekaeders Zusammenfassung der Ergebnisse zur Charakterisierung des DNA-Dodekaeders Trisoligonucleotide mit Überhangsequenz Entfernung der Überhangsequenzen durch Mungbohnen Nuclease Fluorescein-markierte DNA-Dodekaeder Gold-markierte DNA-Dodekaeder Verknüpfung zweier DNA-Dodekaeder mit Überhangsequenzen mittels eines Linkerkonstrukts aus zwei 3 -verbundenen Oligonucleotiden Untersuchungen zur adressierbaren Funktionalisierung von Trisoligonucleotidbasierten Nanostrukturen an einem DNA-Tetraeder mit vier verschiedenen Überhangsequenzen Self-Assembly des DNA-Tetraeders mit vier Überhangsequenzen Adressierbare Funktionalisierung des DNA-Tetraeders - Voruntersuchungen Adressierbare Funktionalisierung des DNA-Tetraeders mit RUBiGOLDmodifizierten Oligonuceotiden Gold-Färbung Hybridisierung der Überhangsequenzen mit RUBiGOLD-modifizierten Oligonucleotiden Höhermolekulare Self-Assembly Produkte Zur Visualisierung Gold-markierter DNA-Tetraeder im Elektronenmikroskop Zusammenfassung der Ergebnisse zur elektronenmikroskopischen Untersuchung von RUBiGOLD-markierten DNA-Objekten Zusammenfassung und Ausblick

3 Experimenteller Teil Spektroskopische Methoden Magnetische Kernresonanzspektroskopie (NMR) Massenspektrometrie Fast-Atom-Bombardment-Massenspektrometrie (FAB) Elektrospray-Massenspektrometrie (ESI) Matrix-Assisted-Laser-Desorption-Ionization-Time-Of-Flight (MALDI-TOF) UV/VIS-Spektroskopie Rasterkraftmikroskopie (AFM) Chromatographische Methoden Dünnschichtchromatographie Säulenchromatographie High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Gelfiltrationschromatographie (GFC) Elektrophoretische Methoden Agarose- und Polyacrylamidgele Geldokumentation Präparative denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese Extraktion aus dem Gel Analytische Polyacrylamid-Gelelektrophorese Analytische denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese Native analytische Polyacrylamid-Gelelektrophorese Native Agarose-Gelelektrophorese Szintillationszähler Sonstige Arbeitsgeräte Chemikalien Verwendete Lösungsmittel Chemikalien Materialien und Chemikalien für molekularbiologische Arbeitstechniken Chemikalien für die automatisierte Oligonucleotidsynthese Biomolekulare Methoden Verdau einzelsträngiger DNA durch Mungbohnen-Nuclease Verdau einzelsträngiger Überhangsequenzen durch Mungbohnen Nuclease Test auf Verdau doppelsträngiger DNA durch Mungbohnen Nuclease Kinasierung mit T4-Polynucleotidkinase Aktivitätskonzentrationen der kinasierten (Tris-)Oligonucleotide DNA-Synthese Lineare Oligonucleotide Trisoligonucleotide Deblockierung und Abspaltung der (Tris-)Oligonucleotide von der Festphase Aufreinigung der (Tris-)Oligonucleotide Synthesen ,3,5-Tris(3-hydroxypropyl)benzol (1)

4 9.2 1,3,5-Tris(bromomethyl)benzol (2) - Umsetzung von 6 mit HBr ,3,5-Tris(bromomethyl)benzol (2) Radikalische Bromierung von Charakterisierung s. unten.trimesinsäure-trimethylester (5) ,3,5-Tris(hydroxymethyl)benzol (6) [3,5-Bis-(2,2-bis-ethoxycarbonyl-ethyl)-phenyl]-2-ethoxycarbonyl-propansäureethylester (7) Carboxy-3-[3-(2,2-dicarboxy-ethyl)-5-dicarboxymethyl-phenyl]-propionsäure (8) ,3,5-Tris(carboxy-ethyl)benzol (9) ,3,5-Tris(carboxyethylmethylester)benzol (10) Carbonsäureallylester 3-[3,5-bis-(3-hydroxypropyl)-phenyl]-propylester (11) Carbonsäureallylester 3-[3-{3-[bis-(4-methoxy-phenyl)-methoxy]-propyl}-5-(3- hydroxy-propyl)-phenyl]-propylester (12) (2-Cyanoethoxy)bis-N,N-(diisopropylamino)phosphan (13) Carbonsäureallylester 3-(3-[3-allyloxy-diisopropylamino-phosphanyloxy)propyl]-5- {3-[bis-(4-methoxy-phenyl)-phenyl-methoxy]-propyl}-phenyl)-propylester (14) S-(+)-5-Oxotetrahydrofuran-2-carbonsäure (19) (2S)-Pentan-1,2,5-triol (20) [(4S)-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl]-propanol (21) (3-[(4S)-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl]hydroxypropyl)-allyloxycarbonat (22) (4S)-Ally-4,5-dihydroxypentylcarbonat (23) (4S)-5-[4,4 -Dimethoxytrityloxy]-4-hydroxypentyl-1-allylcarbonat (24) (2S)-(5-Allyloxycarbonyl-1-(4,4 -dimethoxytrityloxy)pentyl)-o-(β-cyanoethyl- N,N-diisopropyl)phosphoramidit (25) Dichloro(2-cyanoethoxy)phosphan (29) (2-Cyanoethoxy)-2-(2`-O-4,4 -dimethoxytrityloxyethylsulfonyl)ethoxy-n,n diisopropylaminophosphin (30) {2-[Bis-(4-methoxy-phenyl)-phenyl-methoxy]-ethansulfonyl}-ethanol (32) [Bis-(4-methoxy-phenyl)-phenyl-methoxy]-hexan-1-ol (34) (4, 4 -Dimethoxytrityloxy)hexyl-(2-cyanoethyl)-(N,Ndiisopropyl)phosphoramidit (35) S-Trityl-mercapto-hexan-1-ol (37) Thiolmodifier-Amidit N(4)-Benzoyl-desoxycytidin (42a) ,5 -O-Bis(4,4 -dimethoxytrityl)-(n4)-benzoyl-desoxycytidin (43a) O- (4,4 -Dimethoxytrityl)-(N4)-benzoyl-desoxycytidin (44a) O- (4,4 -Dimethoxytrityl)-(N4)-benzoyl-desoxycytidin-5 -O-succinat (45a) (N2)-Isobutyryl-desoxyguanosin (42b) ,5 -O-Bis-(4,4 -dimethoxytrityl)-(n2)-isobutyryl-desoxyguanosin (43b) O-(4,4 -Dimethoxytrityl)-(N2)-isobutyryl-desoxyguanosin (44b) O-(4,4 -Dimethoxytrityl)-(N2)-isobutyryl-desoxyguanosin-5 -O-succinat (45b) ,5 -O-Bis(4,4 -dimethoxytrityl)-desoxythymidin (43c) O- (4,4 -Dimethoxytrityl)-desoxythymidin (44c) O-(4,4 -Dimethoxytrityl)-desoxythymidin-5 -O-succinat (45c) Synthese der Festphasen 46a-c für die reverse Oligonucleotid-Synthese

5 Anhang Berechnete Schmelztemperaturen des Dodekaeder-Sequenzpools Berechnete Duplexenergien der komplementären Sequenzen und der stabilsten Fehlpaarungen des Dodekaeder-Sequenzpools Sequenzen, berechnete Schmelztemperaturen und Duplexenergien des Tetraeder- Sequenzpools Abkürzungen und Akronyme Literaturverzeichnis