8 Zusammenfassung und Ausblick

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1 8 Zusammenfassung und Ausblick Ziel dieser Arbeit war die Synthese einer neuen Generation von Trisoligonucleotiden deren drei Arme in gleicher Weise mit einem C 3h -symmetrischen Linker-Molekül verbunden sein sollten, sodass alle drei Arme dieselben konformativen Einschränkungen erfahren. Basierend auf dem neuen C 3h -symmetrischen Strukturmotiv des Linkers sollte ein Satz von 20 Trisoligonucleotiden hergestellt werden, der durch sequenzadressiertes Self-Assembly ein dodekaedrisches DA-bjekt bilden sollte. Ein DA-Dodekaeder sollte - als verhältnismäßig große DA-anostruktur als Benchmark-Test des Trisoligonucleotid-basierten Synthesekonzepts dienen. Die Stöchiometrie, Konnektivität, Größe und Gestalt der DA-Struktur war durch geeigneten Analysemethoden, wie native Gelelektrophorese, uclease-verdau, radioaktive Markierung, Rasterkraft- und Transmissionselektronenmikroskopie bzw. Kryo- Elektronenmikroskopie zu charakterisieren. Eine adressierbare Funktionalisierung der DA- anostruktur sollte durch Einführung von Trisoligonucleotiden realisiert werden, die in einem Arm um eine zusätzliche, zum Sequenzpool des DA-Gerüsts unabhängige Sequenz verlängert sind. Die Hybridisierung der Überhangsequenz(en) mit Molekülen, die aus einem zur Überhangsequenz komplementären DA-Strang und einem Modul wie z.b. einem Farbstoff oder einem Goldcluster bestehen, sollte dann die gezielte Positionierung der Funktionseinheiten am DA-Gerüst ermöglichen. Die Synthese von Trisoligonucleotiden mit C 3h -symmetrischer Linker-Region konnte durch die Modifikation eines bereits bestehenden Protokolls [82, 84, 90] zur Herstellung von Trisoligonucleotiden umgesetzt werden. Während das bisher verwendete Syntheseprotokoll den zweimaligen Einbau des V as -Linkers 25 vorsieht, können nach dem neuen Protokoll Trisoligonucleotide mit nur einem Trislinker-Molekül hergestellt werden. Dies wird durch den Aufbau des ersten Stranges in 5-3 -Richtung unter Verwendung sog. reverser Phosphoramidite möglich. Durch Kopplung des Linker-Phosphoramidits 14 an das 3 -Ende des ersten Stranges, ist der sukzessive Aufbau des zweiten Arms (nach Detritylierung) und des dritten Arms (nach Pd-katalysierter Abspaltung der AC-Schutzgruppe) in Syntheserichtung möglich, wodurch Trisoligonucleotide mit drei unterschiedlichen Sequenzen und einer C 3h -symmetrischen Linkereinheit zugänglich werden. Für die Darstellung der Trisoligonucleotide am DA-Synthesizer sollte das Linker- Phosphoramidit 14 eingesetzt werden. Dieses wurde synthetisiert, indem ausgehend von Mesitylen (3) zuerst in einer radikalischen Bromierung das 1,3,5-Tris(bromomethyl)benzol 148

2 (2) dargestellt wurde. In einer Malonester-Synthese wurde 2 in das 1,3,5-Tris(carboxyethyl)benzol (9) überführt, welches nach Veresterung zum Methylester 10 mit Lithiumaluminiumhydrid zum Tris-Alkohol 1 reduziert werden konnte. In einer statistischen Reaktion wurde eine Hydroxyfunktion durch Einführung der AC-Schutzgruppe blockiert. ach Trennung des Carbonats 11 von den entstandenen ebenprodukten wurde die DMT-Schutzgruppe, ebenfalls in einer statistischen Reaktion, eingeführt. Die isolierte Verbindung 12 wurde schließlich mit dem Bannwarth-Reagenz 13 zum Phosphoramidit 14 phosphityliert (siehe Abbildung 102). H H Br Br (a) H (b) (c) H Br 9 C H H C P H H (d) AC (f) AC (e) AC DMT DMT H Abbildung 102. Synthese des C 3h -Linkers. (a) Malonester-Synthese. (1) Diethylmalonat, atriumhydrid, Tetrahydrofuran, 3 h, RT. (2) Kaliumhydroxid, Wasser, 16 h, Rückfluss. (3) 3h, 180 C. (b) Veresterung. Methanol, Schwefelsäure, 16 h, Rückfluss. (c) Reduktion. Lithiumaluminiumhydrid, Tetrahydrofuran, 3 h, RT. (d) Einführung der AC-Schutzgruppe. Allyloxycarbonylchlorid, Pyridin, Tehtrahydrofuran, 3 h, RT. (e) Einführung der DMT-Schutzgruppe. 4,4 -Dimethoxytritylchlorid, Pyridin, 16 h, RT. (f) Umsetzung zum Phosphoramidit. Bannwarth-Reagenz 13, Diisopropylammoniumtetrazolid, Dichlormethan, 2 h, RT. Da die Palladium-katalysierte Deblockierung der AC-Schutzgruppe nur an Polystyrol-Festphasen erfolgreich verläuft, mussten für die Synthese der neuen Generation von Trisoligonucleotiden am DA-Synthesizer die reversen Polystyrol-Festphasen 46a-c hergestellt werden, die nicht kommerziell erhältlich sind. Hierfür wurden die 3 --DMT-geschützten 5 --Bernsteinsäureester 45a-c ausgehend von den ucleosiden 39a-c hergestellt und auf eine Amino-modifizierte Polystyrol-Festphase gekoppelt (siehe Abbildung 103). Die erhaltenen Festphasen 46a-c lieferten sehr gute Kopplungseffizienzen und wurden deshalb auch [93, 103, 105, 155, 173] für die Synthesen von Trisoligonucleotiden in anderen Arbeiten verwendet. 149

3 H B 46a: B = 46b: B = H H 46c: B = H DMT H 46a 46b 46c Abbildung 103. Synthetisierte Polystryrol-Festphasen 46a-c für die reverse DA-Synthese. Für die Konstruktion des DA-Dodekaeders wurde ein Sequenzpool von 30 unabhängigen Sequenzen mit ähnlichem Schmelzpunkt von je 15 Basenpaaren mit dem Programm DASequenceGenerator [124] generiert. Die 30 Sequenzen wurden den 30 Kanten des Dodekaeders zugeordnet und es wurde durch Zuordnung der Einzelstränge zu den Ecken des Dodekaeders ein Satz von 20 Trisoligonucleotiden bestimmt. Diese sollten in einem Self- Assembly-Schritt, durch Basenpaarung der komplementären Arme, eine dodekaedrische Struktur bilden, deren Ecken durch die Zentren (C 3h -Linker) der Trisoligonucleotide repräsentiert würden, während die Kanten der dodekaedrischen Struktur durch die doppelsträngigen Verbindungen benachbarter Trisoligonucleotide entstünden. Die 20 Trisoligonucleotide wurden am DA-Synthesizer synthetisiert, über denaturierende Polyacrylamid Gelelektrophorese von ebenprodukten getrennt, durch Gelfiltrationschromatographie entsalzt und massenspektrometrisch charakterisiert (MALDI-TF). Die Trisoligonucleotide wurden in Ausbeuten zwischen 30 und 260 nmol erhalten. Studien zum Self-Assembly des DA-Dodekaeders aus äquimolaren Mischungen der 20 Trisoligonucleotide lieferten einen Satz experimenteller Rahmenbedingungen, unter denen die dodekaedrische Struktur als Hauptprodukt des Self-Assembly entsteht: (a) Die Lösung der Trisoligonucleotide durchläuft ein Annealing-Temperaturprogramm, dass eine Temperatur von 95 C für drei Minuten hält, dann auf die Annealing- Temperatur, die zwischen 45 und 55 C liegt, abkühlt (-0.1 Ks -1 ) und diese für 45 bis 90 Minuten hält, um dann auf 4 C abzukühlen (-0.1 Ks -1 ). Alternativ kann auch ein Annealing-Temperaturprogramm verwendet werden, das die Lösung der Trisoligonucleotide sehr langsam von 95 C auf 4 C (z.b. über einen Zeitraum von 16 Stunden) abkühlt. 150

4 (b) Die atriumchlorid-konzentration des Hybridisierungspuffers sollte mindestens 100 mm betragen. Geringere atriumchlorid-konzentrationen führen zur Bildung kleinerer Aggregate. (c) Die Gegenwart von Magnesiumionen während des Self-Assembly der 20 Trisoligonucleotide führt neben der Bildung des DA-Dodekaeders zur verstärkten Bildung einer Spezies mit geringerer elektrophoretischer Mobilität (evtl. Catenan-artige Strukturen). Die Anwesenheit zweiwertiger Metallkationen wie Zn 2+ und i 2+ begünstigt dagegen die Bildung kleinerer Aggregate. Bei der Zugabe von zweiwertigen Metallionen zum bereits gebildeten DA-Dodekaeder konnte kein destabilisierender Effekt beobachtet werden. (d) Das Self-Assembly des DA-Dodekaeders findet in allen untersuchten gängigen Puffern wie Phosphat-Puffer (ph 7), MES-Puffer (ph 6.7), HEPES-Puffer (ph 7.4) oder TRIS-Puffer (ph 7.6) mit ähnlicher Effizienz statt. (e) Äquimolare Konzentrationen der Trisoligonucleotide v1 v20 im submikromolaren bis mikromolaren Konzentrationsbereich (0.1 und 1.5 µm je Trisoligonucleotid) führen beim Self-Assembly des DA-Dodekaeders zu vergleichbar guten Ergebnissen. Eine Abschätzung der Ausbeute des DA-Dodekaeders aus dem Self-Assembly der Trisoligonucleotide v1 v20 durch densitometrische Auswertung der Banden in nativen Agarosegelen ergab, dass unter den experimentellen Bedingungen bis zu 65 % der eingesetzten Trisoligonucleotide die dodekaedrische Struktur bilden. Bei der Aufnahme einer Schmelzkurve der DA-anostruktur wurde ein Schmelzpunkt von 55 C ermittelt, der im Bereich der für die experimentellen Bedingungen (0.1 µm je Trisoligonucleotid, 200 mm atriumchlorid, 10 mm Phosphatpuffer ph7) berechneten Schmelzpunkte des Sequenzpools des DA-Dodekaeders (54.3 C bis 57.1 C) liegt. Hier wurde wie auch bei den Untersuchungen an Trisoligonucleotiden von Scheffler [82] - keine gegenüber den einzelnen Sequenzen erhöhte Schmelztemperatur der DA-Struktur gefunden, wie sie bei der Untersuchung des DA-Tetraeders von Dorenbeck beobachtet wurde. [84] Die Trisoligonucleotide v1 v20 konnten durch enzymatische (T4-Polynucleotid Kinase) Phosphorylierung der 5 -Enden mit [γ- 32 P] ATP radioaktiv markiert werden. Die Dotierung von Hybridisierungsansätzen von v1 v20 mit 32 P-markierten Trisoligonucleotiden führte nach anschließendem Annealing zum Einbau der markierten Trisoligonucleotide in die DA- anostruktur und ermöglichte nach gelelektrophoretischer Analyse die Aufnahme von Autoradiogrammen. Die Analyse von zwanzig dotierten Dodekaeder-Ansätzen mit ansteigender Anzahl an zugesetzten 32 P-markierten Trisoligonucleotiden zeigte eine lineare Zunahme der 151

5 Radioaktivität in den Banden, die dem DA-Dodekaeder zugeordnet wurden. Dotierungsexperimente, bei denen den Dodekaeder-Hybridisierungsmischungen jeweils nur ein radioaktiv-markiertes Trisoligonucleotid zugesetzt wurde, zeigten nach der gelelektrophoretischen Analyse in den aufgenommenen Autoradiogrammen vergleichbare Bandenintensitäten. Die Ergebnisse beider Experimente sprechen für eine Struktur, die zu gleichen Teilen aus den Trisoligonucleotiden v1 v20 besteht. Die Behandlung des DA-Dodekaeders mit Mungbohnen-uclease zeigte keinen Effekt auf dessen elektrophoretische Mobilität, während sich die elektrophoretische Mobilität von bjekten, die aus Teilsätzen der Trisoligonucleotide v1 v20 bestehen, nach der Behandlung mit Mungbohnen uclease deutlich veränderte (siehe Abbildung 104A). Dies zeigt, dass im vollständig aus v1 v20 assemblierten bjekt keine einzelsträngige DA vorliegt. Die bjekte, die aus Teilsätzen der Trisoligonucleotide v1 v20 bestehen, müssen dagegen einzelsträngige DA enthalten und können daher von der uclease angegriffen werden. Abbildung 104. (A) atives Agarosegel (2 %) des DA-Dodekaeders und von Teilen aus dem Dodekaeder-Set (a) bevor und (b) nach Behandlung mit Mungbohnen uclease (selektiver Verdau einzelsträngiger DA). Bahn M: 100 bp DA-Leiter. Bahn 1a, b: v14 v17. Bahn 2a, b: v13 v17. Bahn 3a, b: v1, v2, v12 v17. Bahn 4a, b: v1, v2, v11 v18. Bahn 5a, b: v1, v2, v5, v6, v11 v18. Bahn 7a, b: v1 v20. Die DA-Assemblies sind vereinfacht als Stabmodelle abgebildet und den entsprechenden Bahnen zugeordnet. Dabei sind zur besseren Unterscheidung doppelsträngige Teile schwarz und einzelsträngige Teile grau gefärbt. (B) Ferguson-Plot Analyse des DA-Dodekaeders in nativen Agarosegelen zwischen 1 % und 3.75 % Agarose. Als Vergleich wurden lineare DA-Doppelstränge von 400 und 500 bp Länge einer DA-Leiter (400 TriDye 100 bp Marker, EB) ebenfalls analysiert. Die Analyse der DA-anostruktur in nativen Agarosegelen zeigte abhängig von der Agarose-Konzentration eine elektrophoretische Mobilität, die etwa zwischen der von linearer dsda von 400 bp (3 % Agarose) bis 450 bp (2 % Agarose) Länge entspricht. In nativen Polyacrylamidgelen (4 %) hat das DA-Dodekaeder dagegen eine deutlich geringere elektrophoretische Mobilität, die etwa mit der von 1000 bp langer dsda übereinstimmt. Die 152

6 tatsächliche Anzahl von insgesamt 450 bp des aus v1 bis v20 zusammengesetzten DA- bjekts stimmt recht gut mit den Ergebnissen aus der Agarose-Gelelektrophorese überein, steht aber im Gegensatz zu den Beobachtungen aus der Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Bedenkt man aber die unterschiedliche Porengröße der beiden Gelmatrices, ist eine unterschiedliche Mobilität des DA-anoobjekts sogar zu erwarten, da in den viel engmaschigeren Polyacrylamidgelen der Einfluß der Gestalt der im Gel wandernden Spezies viel größer ist. Ein Ferguson-Plot der DA-Struktur in nativen Agarosegelen zeigte keine lineare Abhängigkeit des Logarithmus der elektrophoretischen Mobilität von der Gelkonzentration, wie er für rigide sphärische Partikel (wie z.b. Bakteriophagen [144] ) beschrieben wurde. Vielmehr wurde ein konvexer Kurvenverlauf mit abweichenden Segmenten gefunden (siehe Abbildung 104B), wie er bereits für sphärische elastische Partikel beschrieben wurde. [143] Der Ferguson-Plot könnte auf eine gewisse Deformierbarkeit des DA-Dodekaeders hindeuten. Bei der rasterkraftmikroskopischen Untersuchung des DA-Dodekaeders in Lösung wurden diskrete Partikel von etwa 20 nm lateraler Größe beobachtet (siehe Abbildung 105a). Abbildung 105. Untersuchung des Produkts des Self-Assembly der Trisoligonucleotide v1 v20. (a) AFM-Bild, gemessen im Semi-Contact Mode in HEPES-Puffer mit Zusatz von ickelchlorid (1mM). Zahlreiche diskrete bjekte von etwa 20 nm lateraler Größe und etwa 4 nm Höhe sind erkennbar. (b) TEM-Aufnahme (egativ Staining mit Uranylformiat). Viele diskrete Partikel von annährend 20 nm Größe sind zu beobachten. (c) Kryo- Elektronenmikroskopie, Klassensummen (je ca. 30 Bilder). Man erkennt Partikel von etwa 18 nm Durchmesser mit einer Feinstruktur. Während diese Größe gut mit den erwarteten Dimensionen übereinstimmt, spricht die gefundene Höhe der DA-Struktur von nur 4 nm für eine deformierbare Struktur (konsistent mit den Ergebnissen des Ferguson-Plots), die bei der Messung an der Glimmeroberfläche verformt wird. 153

7 Die Untersuchung der DA-Struktur im Transmissionselektronenmikroskop nach Färbung mit Uranylformiat zeigte diskrete Partikel von knapp 20 nm Durchmesser (siehe Abbildung 105b). Die Feinstruktur der DA-bjekte konnte durch kryo-elektronenmikroskopische Untersuchungen weiter sichtbar gemacht werden (siehe Abbildung 105c): Die Bilder der nativen Struktur zeigen ein DA-bjekt von etwa 18 nm Durchmesser. Die aus der Kryo- EM gewonnenen Daten sind in guter Übereinstimmung mit den Ergebnissen aus den TEMund AFM-Untersuchungen. Die ptimierung der Probenvorbereitung für die kryo-elektronenmikroskopische Untersuchung sollte zu kontrastreicheren Bildern des DA-Dodekaeders führen, wodurch eine weitere elektronische Auswertung der Daten vorgenommen werden könnte (Single Particle Reconstruction). Dieses Projekt wird in der Arbeitsgruppe derzeit von Castonguay gemeinsam mit Golas und Sander (Arbeitsgruppe Stark, Max-Planck-Institut für Biophysikalische Chemie Göttingen) weiterverfolgt. Abbildung 106. (a) ative Gelelektrophorese der DA-Dodekaeder mit unterschiedlicher Anzahl von Überhangsequenzen, hybridisiert mit Fluorescein-markierten komplementären ligonucleotiden, abgebildet (A) vor und (B) nach Behandlung mit SYBR Gold. Mit zunehmender Anzahl zugesetzter Fluorescein-Label ist ein Anstieg der Banden-Intensität zu beobachten. (b) atives Agarosegel der DA-Dodekaeder ohne (Bahn 1), mit einer (v17x, Bahn 2) und mit zwei (v17x und v19x, Bahn 3) Überhangsequenzen, hybridisiert mit den komplementären RUBiGLD-markierten ligonucleotiden (R-c und R-e ). Bahn M: 100bp DA Leiter. Das Agarosegel wurde mit GelStar ucleinsäurefarbstoff präpariert (in-gel) und nach beendeter Elektrophorese unter UV- Licht photographiert (A). Um Gold-markierte von nicht-markierten Spezies zu unterscheiden, wurde ein Gold- Staining durchgeführt (B). 154

8 Durch die Einführung von Trisoligonucleotiden, die in einem Arm um eine nicht am Aufbau des Gerüsts beteiligte Sequenz verlängert sind, wurde eine adressierbare Funktionalisierung des DA-Dodekaeders erreicht. Im Rahmen dieser Arbeit konnten sechs verlängerte Trisoligonucleotide synthetisiert und erfolgreich in die DA-anostruktur integriert werden. Durch die Hybridisierung von 5 -Fluorescein-markierten linearen ligonucleotiden mit bis zu sechs Überhangsequenzen eines DA-Dodekaeders konnte gezeigt werden, dass die Überhangsequenzen am DA-Dodekaeder prizipiell für die Hybridisierung von funktionalisierten ligonucleotiden zugänglich sind (siehe Abbildung 106a). Ähnliche Experimente wurden erfolgreich mit RUBiGLD-modifizierten ligonucleotiden durchgeführt. Hierbei konnte zusätzlich ein gemeinsam mit Mönninghoff entwickeltes Verfahren zur selektiven Färbung der Gold-markierten DA-bjekte in nativen Agarosegelen angewendet werden, um die Goldmarkierten DA-Dodekaeder im Gel sichtbar zu machen (siehe Abbildung 106b). Aus den Experimenten zur Verknüpfung zweier DA-Dodekaeder mit Überhangsequenzen durch ein komplementäres Linkerkonstrukt, ist bisher keine eindeutige Aussage möglich, ob durch Hybridisierung der Überhangsequenzen mit dem Linkerkonstrukt das erwartete hantelförmige supramolekulare Produkt zweier Linker-verknüpfter Dodekaeder entsteht. In gelelektrophoretischen Untersuchungen von Hybridisierungsansätzen, die DA-Dodekaeder mit Überhangsequenzen und ein komplementäres Linkerkonstrukt enthielten, konnte neben der Bande, die der dodekaedrischen DA-Struktur zugeordnet wurde, eine zweite Bande mit deutlich geringerer Laufweite beobachtet werden. Das Auftreten dieser Bande spricht prizipiell für die Bildung eines größeren bjekts. Eine Spezies mit sehr ähnlicher elektrophoretischer Mobilität wurde jedoch auch schon bei der gelelektrophoretischen Analyse von Hybridisierungsmischungen beobachtet, bei denen DA-Dodekaeder ohne Überhangsequenzen und ohne Linkerkonstrukt assembliert wurden. b es sich hierbei um Catenane handelt, deren Entstehung während des Self-Assembly prinzipiell möglich sein sollte, konnte noch nicht geklärt werden. Es ist wahrscheinlich, dass die hypothetischen Catenan-artigen bjekte aus zwei DA-Dodekaedern und das ebenfalls aus zwei Dodekaedern bestehende hantelförmige, Linker-verknüpfte Konstrukt eine ähnliche elektrophoretische Mobilität besitzen. Die Annahme, dass zwei verschiedene Spezies (Catenane und DA-Hanteln) mit sehr ähnlicher elektrophoretischer Mobilität beobachtet werden, wird durch zwei experimentelle Befunde gestützt: (1) Durch die radioaktive Markierung des Linkerkonstrukts konnte sicher gezeigt werden, dass eine Bindung des Linkerkonstrukts an die Überhangsequenzen der DA-Dodekaeder stattfindet, womit die Zugänglichkeit der Überhangsequenz für das Linkerkonstrukt bewiesen ist. (2) Bei der gelelektrophoretischen 155

9 Analyse von Kontrollexperimenten, bei denen DA-Dodekaeder ohne Überhangsequenzen mit dem Linkerkonstrukt zusammengebracht wurden, war die Intensität der Bande der Spezies mit geringer elektrophoretischer Mobilität deutlich schwächer als in den Experimenten, bei denen DA-Dodekaeder mit Überhangsequenz und das Linkerkonstrukt zusammengebracht wurden. Es wäre also möglich, dass im Fall der Kontrollexperimente die Bildung von Catenanen beobachtet wird, während bei den Experimenten mit Überhangsequenzen und Linkerkonstrukt (zusätzlich) die verbrückten DA-bjekte entstehen, weshalb hier im Gel intensivere Banden beobachtet werden. Experimente zur Verknüpfung zweier DA-Dodekaeder mit längeren Linkerkonstrukten könnten zu besseren Ergebnissen führen, falls ein zu kleiner Abstand der DA-Dodekaeder der Grund für die geringe Ausbeute des Verknüpfungsproduktes ist. Um ein Protokoll für die Gold-Färbung in Agarosegelen zu entwickeln und um die Eignung von RUBiGLD-modifizierten ligonucleotiden zum Markieren von DA-anostrukturen für die Visualisierung im Transmissionselektronenmikroskop zu untersuchen, wurde ein DA-Tetraeder aus vier Trisoligonucleotiden mit jeweils einer Überhangsequenz als Modell verwendet. Die Wahl des DA-Tetraeders erfolgte aus ökonomischen Gründen, da ein DA- Tetraeder aus nur vier Trisoligonucleotiden hergestellt werden kann, wohingegen für das DA-Dodekaeder 20 Trisoligonucleotide nötig sind. Bei größeren Versuchsreihen konnte so substanzsparend gearbeitet werden. Das hier verwendete DA-Tetraeder besteht aus zwei Trisoligonucleotiden des Dodekaeder-Satzes und zwei neu synthetisierten Trisoligonucleotiden. Die Sequenzen wurden so gewählt, dass deren Schmelzpunkte denen des Dodekaeder-Pools entsprechen. Die Überhangsequenzen sind so positioniert, dass jede Ecke des vollständig zusammengesetzten DA-Tetraeders durch eine Überhangsequenz adressierbar funktionalisiert werden kann. Das Self-Assembly der tetraedrischen Struktur wurde in nativen Gelen analysiert. Eine adressierbare Funktionalisierung konnte anhand der Hybridisierung der Überhangsequenzen mit bis zu vier RUBiGLD-modifizierten linearen ligonucleotiden gezeigt werden. Die Strukturen ließen sich nach der Gelelektrophorese durch ein eigens dafür entwickeltes Protokoll im Gel durch Gold-Färbung nachweisen (Abbildung 107). Erste Untersuchungen der RUBiGLD-markierten tetraedrischen DA-Struktur im Transmissionselektronenmikroskop (TEM) führten nicht zu eindeutigen Ergebnissen. Es wurden zwar Kombinationen von jeweils vier Goldclustern im TEM beobachtet, wie sie durch das (kollabierte) DA-Tetraeder erwartet werden, jedoch lagen die Cluster generell zu dicht, um eine sichere Zuordnung machen zu können. 156

10 Abbildung 107. Gelelektrophoretische Analyse von DA-Tetraedern mit vier Überhangsequenzen, die mit vier (Bahn 1), drei (Bahn 2), zwei (Bahn 3), einem (Bahn 4) und keinem (Bahn 5) der komplementären RUBiGLDmodifizierten ligonucleotide zusammengebracht wurden. (a) Das Gel wurde unter UV-Licht im Gel-Imager photographiert. (b) Anschließend wurde eine Gold-Färbung vorgenommen und das Gel wurde mit einer Digitalkamera photographiert (rechts). Bahn M: 100 bp DA-Leiter. Eine verbesserte Probenpräparationsmethode, die eine sichere Abtrennung der RUBiGLDmarkierten DA-Tetraeder von nicht-markierten DA-bjekten und überschüssigen RUBiGLD-ligonucleotiden sowie eine optimale Konzentration des Analyten bei der Benetzung der Proben-Grids einschließt, sollten zu aufschlussreicheren TEM-Aufnahmen führen. Weiter wäre zu überprüfen, ob das Gold-markierte DA-Tetraeder auch mit kryoelektronenmikroskopischen Methoden visualisiert werden kann. Aus den in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnissen geht hervor, dass das Trisoligonucleotidbasierte Konzept auch für die Darstellung größerer anokonstrukte wie einem DA- Dodekaeder anwendbar ist. Das Self-Assembly der 20 Trisoligonucleotide mit individuellen Sequenzen liefert die dodekaedrische Struktur als das Hauptprodukt und bestätigt das Konstruktionsprinzip der maximalen Instruktion (siehe Kapitel 1.4), also der Codierung 157

11 jeder Konnektivität durch eine einzigartige Sequenz. Die erfolgreiche Einführung von bis zu sechs Trisoligonucleotiden mit Überhangsequenz ermutigt zur weiteren Funktionalisierung der DA-Struktur. Hierfür werden gegenwärtig bereits weitere Trisoligonucleotide mit Überhangsequenzen hergestellt. [155] Die räumlich definierte Positionierung von Fluoreszenzfarbstoffen, -Quenchern, Goldclustern und Proteinen an DA-anogerüsten wie dem DA- Dodekaeder wird Gegenstand zukünftiger Untersuchungen sein. So könnte die systematische Markierung der Dodekaeder-Ecken mit Goldclustern in der Kryo-Elektronenmikroskopie weitere Informationen über die Gestalt des DA-Gerüsts liefern. So ist bisher unklar, ob aus dem Self-Assembly der Trisoligonucleotide auch Topoisomere des DA-Dodekaeders hervorgehen. Diese Frage könnte über Kryo-EM-Untersuchungen von DA-Dodekaedern mit strategisch markierten Ecken beantwortet werden. Die adressierbare Funktionalisierung der DA-anostrukturen könnte Anwendungsmöglichkeiten eröffnen, wie sie durch Ansätze, die auf dem Self-Assembly von DA-Polyedern aus nur einem DA-Verzweigungselement beruhen, nicht möglich sind. [57, 174] Die Adressierbarkeit jeder Ecke des DA-Gerüsts sollte die Herstellung einer hohen Zahl verschiedenfunktionalisierter Spezies erlauben und kombinatorische Ansätze mithilfe des DA-Gerüsts ermöglichen. Das dodekaedrische DA-Gerüst könnte als molekulare Kapsel fungieren oder, wenn das Problem der Verknüpfung der anostrukturen gelöst ist, als Baustein für größere DA-Architekturen dienen. 158