DETEKTOREN. Analytische Chemie (für Biol. / Pharm. Wiss.) Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophorese) Dr. Martin Pabst

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1 Analytische Chemie (für Biol. / Pharm. Wiss.) Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophorese) Dr. Martin Pabst HCI D323 martin.pabst@org.chem.ethz.ch ETH Zurich Dr. Thomas Schmid Dr. Martin Pabst, martin.pabst@org.chem.ethz.ch DETEKTRE 2

2 Flüssigchromatographie (LC) Detektoren Detektor Trennsäule 3 1. UV/VIS-Detektor (ultraviolet/visible) UV: 190 bis 400 nm VIS: 400 (violett) bis 800 nm (rot) Signal: Grundlinie: Prinzip: Extinktion von Eluent + Analyt Extinktion des Eluenten (oft automatisch abgezogen) Messung der optischen Transmission (wie bei einem UV/VIS-Spektrometer) 4

3 UV/VIS-Detektor Lichtintensität Lichtintensitä d Lambert-Beersches Gesetz E = lg I 0 I = ε ( λ ) c d I 0 Probe I E... Extinktion ε... Extinktionskoeffizient c... Konzentration Abstand d... Schichtdicke Hohe Schichtdicke der Messzelle für eine empfindliche Detektion Geringes Volumen der Messzelle zur Verhinderung zusätzlicher Peakverbreiterung ( extra column effects ) 5 UV/VIS-Detektor Lichtintensität Lichtintensitä d I 0 Probe I Abstand Hohe Schichtdicke der Messzelle für eine empfindliche Detektion Geringes Volumen der Messzelle zur Verhinderung zusätzlicher Peakverbreiterung ( extra column effects ) 6

4 Varianten des UV/VIS-Detektor Festwellenlängengeräte (z.b. Hg-Dampflampe mit λ = 254 nm) Geräte mit variabler Wellenlängeneinstellung Dioden array detektoren (DAD) 7 UV/VIS-Detektor mit variabler Wellenlängeneinstellung Lichtquellen: Deuteriumlampe (λ = nm) und/oder Wolfram-Halogenlampe (λ = nm) Wellenlänge wählbar mittels eines Monochromators (z.b. Prisma + Spalt) 8

5 UV/VIS-Detektor Diodenarraydetektor (DAD) Polychromatische Anregung (Deuteriumlampe und/oder Wolfram-Halogenlampe) Zu jedem Zeitpunkt wird das ganze Spektrum von einem Diodenarray erfasst. 9 UV/VIS-Detektor Der UV/VIS-Detektor erfasst nur Analyten, die ausreichend UV-Strahlung bzw. sichtbares Licht (VIS) absorbieren. Bei kleinen Wellenlängen um 200 nm absorbieren viele Substanzen, meist aber auch der Eluent. Das Absorbptionsmaximum des Analyten soll längerwellig als die Eluentabsorption sein. UV/VIS-aktiv: R R R (polyzyklische) Aromaten, konjugierte Doppelbindungssysteme Doppel- und Mehrfachbindungen Carbonylgruppen C= Br, I 10

6 2. Brechungsindexdetektor (refractive index detector = RID) Signal: Prinzip: Brechungsindex-Änderung im Vergleich zum Eluenten Durchflussrefraktometer Messung der Änderung von Brechungswinkeln - Vielseitig, da praktisch jeder Analyt den Brechungsindex ändert, aber unspezifisch - Empfindlichkeit bei vielen Analyten um 2 3 Grössenordnungen schlechter als bei UV/VIS- Detektion. icht kompatibel mit Gradientenelution. - Verwendung: Zuckerbestimmung in Wein 11 Verdampfungs-Lichtstreudetektor (evaporative light scattering detector = ELSD) Signal: Prinzip: Intensität des an festen Analytpartikeln gestreuten Lichts Eluent + Analyt werden fein vernebelt. Lösungsmittel verdampft Das an den festen Analytpartikeln gestreute Laserlicht wird von einem Photodetektor erfasst Universeller Detektor Siedepunkt Eluent < Siedepunkt Analyten Kompatibel mit Gradientenelution Inkompatibel mit salzhaltigen Eluenten 12

7 Fluoreszenz-Detektor I f I 0 Φ ε( λ Anregung ) c d I f... Fluoreszenzintensität Φ... Quantenausbeute ε... Extinktionskoeffizient c... Konzentration d... Schichtdicke λ Emission λ Anregung (Rotverschiebung) Im Gegensatz zu UV/VIS: Signal(Photodiode) = 0 bei c = 0 Signal I 0 13 Fluoreszenz-Detektor Signal: Fluoreszenzintensität Prinzip: Anregung mit einer definierten Wellenlänge (Lichtfilter 1) Detektion meist im 90 - Winkel der rot verschobenen (Lichtfilter 2) Fluoreszenzstrahlung Sehr empfindlich (Faktor besser als UV/VIS) icht universell abhängig von der chemischen atur der Analyten ur fluoreszierende Analyten (z.b. polyzyklische Aromaten), alternativ: Derivatisierung 14

8 3.Massendetektoren Um Analyten mit Massenspektrometern zu detektieren, muss man die Analytenmoleküle vorher ionisieren! = IEQUELLE ESI = Electrospray ionization EI = Electron impact ionization CI = Chemical Ionisation MALDI = Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (Selten an LC gekoppelt) 15 LC-ESI-MS (ESI = electrospray ionization) Ausgang der Trennsäule ESI produziert Pseudo- Molekülionen [M+H] + Weiches Ionisationsverfahren, das unfragmentierte Pseudomolekülionen erzeugt Fragmentierungen zur Strukturaufklärung in Massenspektrometern mit Kollisionszelle möglich (z.b. Triple-Quadrupol-MS oder Quadrupol-TF-MS) Massenselektive Detektion (sogar koeluierende Analyten werden getrennt detektiert) Stabil-isotopenmarkierte Verbindungen als interner Standard möglich ESI: v.a. für Moleküle mit protonierbaren oder deprotonierbaren funktionellen Gruppen 16

9 LC-APCI-MS (APCI = atmospheric pressure chemical ionization) Ausgang der Trennsäule Weiches Ionisationsverfahren, das unfragmentierte Pseudomolekülionen erzeugt Fragmentierungen zur Strukturaufklärung in Massenspektrometern mit Kollisionszelle möglich (z.b. Triple-Quadrupol-MS oder Quadrupol-TF-MS) Massenselektive Detektion (sogar koeluierende Analyten werden getrennt detektiert) Stabil-isotopenmarkierte Verbindungen als interner Standard möglich APCI: auch für kleine Moleküle ohne polare funktionelle Gruppen gut geeignet 17 Vergleich: LC-Detektoren (HPLC oder LC) Detektor Empfindlichkeit Linearbereich Analyten UV/VIS UV- und VIS-Absorber RID + universeller Detektor ELSD o ++ universeller Detektor Fluoreszenz Fluorophore Elektrochemisch ++ / reduzier- und oxidierbare Analyten MS + / / ++ universeller Detektor + massenselektive Detektion + Massenspektren zur Strukturaufklärung Ausführlichere Tabelle in: Cammann, Instrumentelle Analytische Chemie 18

10 Derivatisierung Derivatisierung: Wenn Analyten nicht oder mit ungenügender Empfindlichkeit durch einen bestimmten Detektor erfasst werden können. Umsetzung z.b. mit Fluorophoren oder starken UV-Absorbern Fluoreszenz z.b. primäre Amine UV/VIS z.b. Aldehyde und Ketone H 3 C CH 3 + H 2 R - HCl H 3 C CH R 1 R 2 - H S Cl S H R H H 2 H R 1 5-(,- Dimethylamino)- naphthalin- 1-sulfonylchlorid = Dansylchlorid Blau-blaugrün fluoreszierende Sulfonamide 2,4-Dinitrophenylhydrazin = DPH R 2 DP-Hydrazone max 360 nm 19 Beispiele: HPLC-Trennungen 20

11 Anwendungsbeispiele HPLC H 3 C S H3 C CH 3 Cl H Trennung von Pestiziden Säule: C18 (RP) Eluenten: Wasser Acetonitril 55%:45% Flussrate: 1 ml/min Detektor UV = 225 nm 1. Benfuresate 2. Dymron 3. Iprodione 4. Pyrazoxyfen 5. Tebufenozide 6. Iprodione Metabolite 7. Pencycuron t (min) 21 Anwendungsbeispiele HPLC Trennung von polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAHs) t (Minuten) Säule: C18 (RP) Eluenten: (A) Wasser (B) Acetonitril Gradient: 0 10 min 48% A, 52% B 16 min 20% A, 80% B 21 min 0% A, 100% B 28 min 0% A, 100% B 30 min 48% A, 52% B 30 min stop Flussrate: 1 ml/min Detektor UV = 260 nm 22

12 Anwendungsbeispiele HPLC H Uracil H H 2 CF 3 H 3 C H H H Sertralin Cl Cl HPLC-Trennung von Serotonin-Wiederaufnahmehemmern (Antidepressiva) Stationäre Phase: Cyanopropyl-Kieselgel Verunreinigung Fluvoxamin H Mobile Phase: Wasser (Phosphatpuffer, ph 7) Acetonitril 40%:60% CF 3 Fluoxetin Flussrate: 1 ml/min Detektor: UV, = 230 nm Schlechte Retention der teilweise protonierten Amine auf RP-18-Phase, gute Trennung auf Cyanopropyl-Phase 23 Vergleich: LC-Detektoren (HPLC oder LC) Detektor Empfindlichkeit Analyten UV/VIS + UV- und VIS-Absorber Fluoreszenz +++ Fluorophore MS + / +++ universeller Detektor massenselektive Detektion MSn (Fragmentierung) zur Strukturaufklärung Derivatisierung: Markieren von Analyten mit UV- oder fluoreszenzaktiven Molekülen: Fluorescein FITC fluorescin- Iso thiocyanate Emission bei höherer Wellenlänge! 24

13 UV Detektor Detektoren sind selektiv HPLC-Analyse von livenölproben. UV-Detektion bei zwei Wellenlängen. DAD = Diode Array Detektor 25 UV und RI Detektor Untersuchung einer Bierprobe Kombination von 2 Detektoren (1) Brechungsindexdetektor (RI): universell: erfasst alle Analyten (2) UV/VIS-Detektor (280 nm): für einige Analyten empfindlicher als RI Peak 9: 5-Hydroxymethylfurfural Peak 8: Ethanol J. Chromatograph. Sci. 39 (2001)

14 Massendetektoren Um Analyten mit Massenspektrometern analysieren zu können, muss man diese vorher ionisieren = IEQUELLE ESI = Electrospray ionization EI = Electron impakt ionization CI = Chemical Ionization MALDI = Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (selten mit Trenntechnik gekoppelt) 27 Massendetektoren 2 Spuren "Chromatogram" TIC = total ion current Trennung von Metaboliten aus tierischen Zellen (CH) Säule: Porous Graphitized Carbon (PGC) Eluenten: Wasser / Acetonitril Flussrate: 5 ul/min 2 1 Massenspur Detektor ESI-MS 1. ATP (506) 2. ADP (426) 3. AMP (346) 3 All (M-H)- 28

15 Massendetektoren Analyten getrennt betrachtbar Chromatogram TIC = total ion current Trennung von Metaboliten aus tierischen Zellen (CH) 1 SIM = single ion monitoring Säule: PGC 2 m/z = 506 m/z = 426 Eluenten: Wasser / Acetonitril Flussrate: 5 µl/min Detektor ESI-MS 3 m/z = ATP (506) 2. ADP (426) 3. AMP (346) All (M-H)- 29 Anwendungsbeispiele HPLC TIC HPLC-MS-Trennung von Triglyceriden A) Gesamtionenstrom (total ion current = TIC) B) Single ion monitoring = SIM Masse 1 Masse 2 Masse 3 Masse 4 30

16 Anwendungsbeispiele HPLC Analyse der Probe ohne vorhergehende Trenntechnik oft auch bei MS nicht möglich. Chromatographie trotz Massenselektiven Detektor meist notwendig/sinnvoll! Zu viele Analyten mit den gleichen oder ähnlichen Massen (isobare Analyten) Schlechte Ionisierung durch Hintergrundsubstanzen der Probe (Salze, kleine polare Analyten...) Hunderte Analyten in einem kleinem Massenbereich Identifizierung nicht mehr möglich! 31 Anwendungsbeispiele HPLC HPLC-ESI-MS-Trennung von Mykotoxinen (Giftstoffe aus Schimmelpilzen) m/z = m/z = m/z = m/z = m/z = m/z = m/z = m/z = Aflatoxin B 1 Säule: C18 (RP) Eluent: Wasser (+ H 4 Ac) + Acetonitril 32