6. Chromatographie (LC: Flüssigchromatographie)

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1 Analytische Chemie 2016/18 6. Chromatographie (LC: Flüssigchromatographie) 1

2 6. Chromatographie - Gliederung 6.1 Einführung 6.2 Definition 6.3 Prinzip der Chromatographie 6.4 Systematik der Chromatographie 6.5 Das Chromatogramm und seine Aussagen 6.6 Das Chromatogramm - quantitativ 6.7 Das Chromatogramm - Parameter 6.8 Das Chromatogramm Formeln 6.9 Bandenverbreiterung innerhalb der Säule 6.10 Partikelgröße vs. Trennstufenhöhe H [µm] 6.11 Partikelgrößenverteilung von 3 µm-material 6.12 Chemische Modifizierung von Trennphasen 2

3 6. Chromatographie 6.1. Einführung Cvet, Farbenlehre, Synonym, Kryptonym, Krypta Farbe, chroma, Boot-Rennen 3

4 1906 Chromatographie Cbet (Tswett): russ.botaniker; 4

5 6. Chromatographie 6.1. Einführung Boot-Rennen der Chromatographie 5

6 6. Chromatographie 6.1. Einführung K c stationär c mobil K: Verteilungskoeffizient c stationär : Konzentration einer Substanz in der stationären Phase c mobil : Konzentration einer Substanz in der mobilen Phase 6

7 6.1 Einführung 7

8 6.1 Einführung 8

9 6. Chromatographie 6.2. Definition Ist ein Trennprozeß, bei dem das Probengemisch zwischen 2 Phasen im chromatographischen Bett (Trennsäule oder Ebene) verteilt wird. Die eine Hilfsphase - die stationäre Phase - ruht. Die andere Hilfsphase - die mobile Phase - strömt daran im chromatographischen Bett vorbei. 9

10 6.3 Prinzip der Chromatographie Säule Substanz 1 Substanz 2 Stat. Phase Mob. Phase (Eluent) Detektion der Substanzen (Peaks) Signal Chromatogramm Probenaufgabe Detektor Detektor Detektor t1 t2 t3 tsubstanz 1 tsubstanz 2 Zeit 10

11 6.4 Systematik in der Chromatographie Trennmethoden: Elektrophorese Chromatographie Chromatographie: LC - SFC - GC LC: Säulenchromatograph.: HPLC, BioLC Planarchromatographie: PC, DC, TLC 11

12 6.5 Das Chromatogramm und seine Aussagen Chromatogramm ( qualitativ ) Signal S 2 S 1 S 0 Probenaufgabe t 0 t R1 t R2 Retentionsszeit t R t 0 Totzeit einer nicht retardierten Substanz S 0 t R1 Retentionszeit der Substanz S 1 t R2 Retentionszeit der Substanz S 2 12

13 6.6 Das Chromatogramm - quantitativ Signal S 1 S 2 S 0 Probenaufgabe h 0 h 1 h 2 A 0 A 1 A 2 Zeit 13

14 6.7 Das Chromatogramm - Parameter Tangenten w h Peakbreite in halber Höhe Peakhöhe h Peakbasisbreite w b a b 14

15 6.8 Das Chromatogramm: Formeln R 1 4 ( α - 1 ) N R : Chromatographische Auflösung k 1 + k α : Selektivität N : Trennstufenzahl k : Kapazitätsfaktor k α 2 k 1 N 2 t R σ 2 L H k t R - t 0 t 0 15

16 6.9 Bandenverbreiterung innerhalb der Säule 1. Ursache : Eddy-Diffusion (Streudiffusion) ideal real Sieb Partikel Säule Mobile Phase stationäre Phase Peakprofil zu Beginn der Trennung Peakprofil nach der Trennung 16

17 6.9 Bandenverbreiterung innerhalb der Säule 2. Ursache : Strömungsverteilung Partikel Partikel 3. Ursache : Diffusion der Probemoleküle in der mobilen Phase 4. Ursache : Stoffaustausch zwischen mobiler " stagnierender mobiler " und " stationärer " Phase 17

18 6.9 Bandenverbreiterung innerhalb der Säule Van-Deemter-Gleichung H(HETP) A + B u + C u H : Bodenhöhe ( "high equivalent to a theoretical plate", HETP ) u : lineare Strömungsgeschwindigkeit A : Eddy-Diffusion (Streudiffusion) + Strömungsverteilung B : Längsdiffusion C : Stoffaustauschphänomene 18

19 6.9 Bandenverbreiterung innerhalb der Säule Van-Deemter-Kurve H [µm] Resultierende H-u-Kurve, Van-Deemter-Kurve C H min B A u optimal u[cm/min] A Bandenverbreiterung durch Eddy-Diffusion und Strömungsverteilung B Bandenverbreiterung durch Längsdiffusion C Bandenverbreiterung durch Stoffaustauschphänomene 19

20 6.10 Partikelgröße vs. Trennstufenhöhe H [µm] µm Trennstufenhöhe H (µm) µm 5 µm 3 µm 1,0 Flußrate F (ml/min) Lineare Geschwindigkeit u (cm/s) 20

21 6.11 Partikelgrößenverteilung von 3µm-Material Teilchgrößenverteilung (%) dp 10 dp 50 dp Korngröße (µm) 21

22 6.12 Chemische Modifizierung von Trennphasen 1. Veresterung mit Alkohol Si OH + HO R Si OR + H O 2 2. Umsetzung mit Thionylchlorid / Aminen Si OH + SOCl 2 Si Cl + SO + HCl 2 Si Cl + H N R Si NH R + HCl 2 22

23 6.12 Chemische Modifizierung von Trennphasen 3. Umsetzung mit Chlorsilanen CH 3 Si OH + Cl Si R CH 3 CH 3 Si O Si R + HCl CH 3 23

24 Funktionelle Gruppen am Silicagel Octadecyl (ODS, C18) Octyl Hexyl Trimethyl Phenyl Dimethylamino Aminopropyl Nitro Nitril Alkylnitril Hydroxyl (Diol) 24

25 6. Chromatographie 6.A Säulenfüll-Apparatur, HPLC-Apparatur 25

26 Säulenfüllapparatur Pumpe (600 bar) Slurry VS Druckflüssigkeit Filter NS Trennsäule/ Hauptsäule Waste 26

27 HPLC-Apparatur Probenaufgabe Pumpe Dämpfung Filter Injektor Manometer He Elutionsmittelvorratsgefäß PC Integrator Integrator PC Vorsäule Chromatogramm Chromatogramm Hauptsäule Detektor 2 Fraktionssammler Detektor 1 Waste 27

28 HPLC-Injektionsventil Normaldruck Einlaß Hochruck- Pumpe Hochruck Hochruck- Pumpe Probeschleife Säule Probeschleife Säule Auslaß Normaldruck A : Füllen der Probeschleife bei Normaldruck B : Injektion der Probe auf die Säule unter Hochdruck 28

29 Mikrodurchflußküvette eines HPLC-Detektors Säuleneluat Kapillare : 0,15 mm UV-Licht d: 1cm : 1mm Küvettenfenster Küvettenfenster Empfänger Absorption Peak Kapillare : 0,5 mm Küvettenablauf 29

30 Funktion einer Doppelkolbenpumpe in der HPLC Auslaßventil Dichtung Dichtung Dichtung Ventilkugeln Dichtung Saphir Dichtung Dichtung Saphir Dichtung Kolben Kolben Dichtung Einlaßventil 30

31 Isokratische Elution und binäre Gradienten 100 isokratisch (z.b. ACN / Wasser 90:10) Acetonitrilgehalt(%) konvex stufenförmig konkav linear Gradientenverläufe Zeit (min) 31

32 Flüssig-Chromatographie Klassische Säulenflüssig- Flüssigchromatographie LC Hochleistungsflüssigchromatographie HPLC Tswett 1906, Trennung von Pflanzenfarbstoffen 1965 / 68, HPLC Säulen 1m x 3 cm, Meter / cm-bereich 25 cm x 4,6 mm (cm / mm-bereich) Eluentförderung Säulenmaterial Glas Stahl, gehärtetes Glas Stationäre Phasen Silikagel, Aluminiumoxid Silikagel, Polymere Korngröße d. Füllung µm oberer µm-bereich Hydrostatisch, Schlauchpumpe bis max 0,5 MPa (5 bar) 3-10 µm unterer µm-bereich Hochdruckpumpen, 1- max. 20 MPa 32

33 Flüssig-Chromatographie Klassische Säulenflüssig- Flüssigchromatographie LC Hochleistungsflüssigchromatographie HPLC Hydrostatisch, wenige bar MPa: Silikagel bar : Polymere Säulenfülldruck Säulenvordruck ca. 1 bar 20 - max. 200 bar Flußrate mehrere ml / Stunde ml / min Analysenzeit Stundenbereich Minuten-(Sekunden) Bereich Probemenge Gramm-Bereich Mikrogamm-Bereich Bodenzahl Anzahl der Peaks

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