Fragen zur Chromatographie

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1 1 Fragen zur Chromatographie Von Studenten für Studenten 1. Aus welchen vier Hauptteilen besteht ein Flüssig-Chromatographie-Gerät? Pumpe Injektor Säule Detektor 2. Ist bei der chromatographischen Trennung prinzipiell eher eine hohe oder niedrige Fließgeschwindigkeit von Vorteil? Eine hohe Fließgeschwindigkeit, da so die störende Diffusion auf der Säule vermindert wird. 3. Welches Problem besteht bei der Verwendung von Wasser als Eluens bei einer Kieselgelsäule? Es kann Kieselsäure ausgeschwemmt werden. 4. Was ist der Nachteil einer Einkolbenpumpe? Hohe Pulsation. 5. Unterscheide (Vor- und Nachteile) von Gas- und Flüssig-Chromatographie? Vorteile der GC: schnell, wenig Substanz nötig, wenig Verbrauchsmaterial, wenig Entsorgungsprobleme, leicht mit MS zu koppeln Vorteile der HPLC: mehr Anwendungsbereiche, analytische Trennung auf präparative Trennung übertragbar, zerstörungsfreie Analytik. 6. Nennen Sie drei unterschiedliche Detektoren. UV, Fluoreszens, Refraktometer, optische Drehung, Chemolumineszens, Leitfähigkeit, 7. Geben Sie die Druckbereiche für HPLC, MPLC, Blitz-Chromatographie und Schwerkraftsäule an. HPLC: > 100 bar, MPLC: > 10 bar, Blitz-Chromatographie: > 1 bar, Schwerkraftsäule: Normaldruck 8. Welche Ansprüche werden an ein gutes Trennsystem gestellt. Nennen Sie drei Anforderungen. Kleine Packungsteilchen, gleichmäßige Packungsteilchen, gleichmäßige Säulenfüllung, gleichmäßige Dicke der wechselwirkenden Schicht, wenig viskoses Laufmittelmittel. 9. Wie macht sich eine schlecht gepackte Trennsäule im Spektrum bemerkbar? Hier gibt es viele Möglichkeiten, z.b. Fronting, Tailing, Schultern, Doppelsignale, usw. 10. Wie lautete die Formel für den Kapazitätsfaktor k?

2 2 k = Retentionszeit/Totzeit 11. Was ist der Hauptgrund für die Signalverbreiterung? Zu starke Diffusion der zu trennenden Substanzen. Dies kann verursacht werden durch verschiedene Weglängen in der Säule (Mehrwegeffekt z.b. aufgrund unregelmäßiger Packung oder zu dicker Leitungen), Längsdiffusion, Behinderung des Soffaustauschs in der mobilen Phase und Behinderung des Soffaustauschs in der stationären Phase. 12. Wie läßt sich übermäßige Peakverbreiterung verhindern? Durch gleichmäßige, kleine Packungsteilchen, hohe Reinheit des Packungsmaterials (z. B. Metallionen führen zu unspezifischen Wechselwirkungen), Verwendung sphärischer Packungsmaterialien und einer Anlage (Leitungslänge und Dimension), die dem entsprechenden Fluss angepasst ist. 13. Was sind mögliche Probleme bei der chromatographischen Trennung von Enantiomeren? Enantiomere können nur aufgrund der Wechselwirkung mit einer chiraler Phase oder chiralem Laufmittel getrennt werden. Diese sind in der Regel sehr teuer. Eine Vorhersage, welche Phase am besten geeignet ist, ist meistens schwierig. Häufig ist es sinnvoll, Enantiomere erst mit einem enantiomerenreinen Reagenz zu derivatisieren und die resultierenden Diastereomere dann an einer achiralen Phase zu trennen. Diese Derivatisierung setzt jedoch eine geeignete funktionelle Gruppe bei den zu trennenden Verbindungen voraus und bedeutet zusätzlichen Arbeitsaufwand. 14. Was sollten Sie machen, wenn das Signal einer nicht oder kaum mit dem Trennsystem wechselwirkenden Substanz einen Symetrieindex (Si) größer 1,3 zeigt? Die Säule regenerieren oder wechseln, da bei einem Si > 1,3 die Signale durch die Säule erheblich verbreitert werden, so dass eine gute Auflösung für analytische und präparative Trennungen meist nicht mehr gegeben ist. 15. Wie kann Silicagel zur Trennung unpolarer Substanzen modifiziert werden? Unpolare Substanzen wechselwirken kaum mit einer polaren Phase, so dass keine brauchbare Trennung erzielt werden kann. Die Umsetzung der freien OH-Gruppen des Kieselgels mit Chlorsilanen koppelt Alkylreste an das Kieselgel, wodurch die Oberfläche des Kieselgels deutlich unpolarer wird. 16. Welche Nachteile bringt die Druckerhöhung mit Gas bei der Blitzchromatographie mit sich? Beim Entspannen am Ende der Säule kann Blasenbildung auftreten (stört im Detektor), bei Glasbruch sehr große Verletzungsgefahr. 17. Was bedeutet RP-Chromatographie? Reversed Phase Chromatographie, d.h. statt der klassischen polaren stationären Phase wird hier eine unpolare Phase verwendet.

3 3 18. Warum wird bei der Reversed-Phase-Chromatographie kein Ethanol verwendet, Methanol hingegen schon? Ethanol hat eine zu hohe Viskosität, vor allem bei Mischungen mit Wasser. 19. Kann eine Chromatographie während des Betriebes gestoppt werden ohne die Trennung zu verschlechtern? Nein, weil die Diffusion in dieser Zeit der bereits erreichten Trennung auf der Säule entgegen wirkt und zu einer großen Signalverbreiterung führt. 20. Die elutrope Reihe ordnet die Solventien nach ihrer Elutionskraft. Geben Sie je ein Beispiel für ein stark, ein mittel und ein schwach eluierendes Solvens bei der Chromatographie an Kieselgel! Stark eluierend: Methanol Mittel eluierend: THF Schwach eluierend: Toluol 21. Vorgegeben sei ein Chromatogramm: Lesen Sie die Totzeit, die Retentionszeit, den Symmetrieindex und den Kapazitätsfaktor ab und berechnen Sie die Trennstufenzahl und Trennstufenhöhe! Als Lösung wird hier auf das Lehrbuch von Veronica Meyer verwiesen. Siehe Literaturempfehlung 22. Welche Probleme ergeben sich bei einer schlecht gepackter Säule? Schlechte oder keine Trennung möglich. 23. Welche Ursachen können zur Signalverbreiterung führen? Diffusion, Fliesgeschwindigkeit, Packungsqualität, Trennmaterialqualität, Aufbau der Trennanlage, Unspezifische Wechselwirkungen mit Trennmaterial oder Lösemittel. 24. Mit welchen Problemen muss man rechnen, wenn man Enantiomere mittels Chromatographie trennen möchte? Teure, spezielle Phasen, die meist nur für wenige Substanzen geeignet sind. 25. Worin liegt die große Bedeutung der RP-Chromatographie begründet? Trennbedingungen für fast alle Verbindungen möglich, schnelle Umkonditionierung und steile Gradienten möglich, häufigste verwendete Flüssigchromatographie. 26. Was zeichnet ein gutes Trennsystem aus? Kurze Analysenzeiten, wenig Leerlauf zwischen den einzelnen Signalen, symetrische, scharfe Signale.

4 4 27. Gibt es Nachteile bei der Flash-Chromatographie bezüglich der Druckerhöhung? Der Druck kann bei manuellem Betrieb nicht gehalten werden, bei angelegtem Gasdruck kommt es durch gelöste Gase zur Blasenbildung in der Säule oder dem Getektor. Gefahr eines gefährlichen Glasbruchs bei angelegtem Gasdruck. 28. Was ist Reversed Phase Chromatographie? Die polaren Gruppen des Kieselgels werden mit z.b Silanen ungesetzt, sodass die neue wechselwirkende Schicht jetzt unpolar ist. 29. Wie ist der Symmetrieindex definiert? Der Symmetrieindex beschreibt die Abweichung des Signals von der idealen Gauss- Kurve. Die Peaksymmetrie wird in einer Höhe von 10% der gesamten Peakhöhe bestimmt. T = b 0.1 /a 0.1. T sollte nicht größer als 1.3 oder kleiner als 0.9 sein 30. Was versteht man unter einem Gradientensystem? Eine Pumpe, die die Zusammensetzung der mobilen Phase während der Analyse ändert. 31. Was versteht man unter dem Totvolumen? Totvolumina sind z.b. Volumina aller Leitungen, Verschraubungen etc. Sie müssen möglichst klein gehalten werden, weil es sonst zu einer Bandenverbreiterung kommt. 32. Was ist die Totzeit? Als Totzeit bezeichnet man die Zeit, die die mobile Phase benötigt, um vom Injektor durch die Trennsäule ohne Wechselwirkung bis zur Mitte der Detektorzelle zu wandern. 33. Welche Substanzen eignen sich allgemein zur Bestimmung der Totzeit? Substanzen, die annähernd keine Wechselwirkung mit der stationären Phase zeigen und gut detektierbar sind, z.b. Alkene auf Silikagelsäule, Thioharnstoff auf RP-Phasen. 34. Welche unterschiedlichen Arten von Chromatographie kennen Sie? Gaschromatographie, Flüssigchromatographie zur Trennung von Substanzgemischen. 35. Welche physikalischen Gesetze liegen der Chromatographie zu Grunde? Unterschiedliche Verteilung verschiedener Substanzen zwischen zwei Phasen. 36. Was ist der R f -Wert und wie wird er berechnet? Quotient aus der Strecke, die die zu bestimmende Substanz zurückgelegt hat und der Strecke, die das Eluens zurückgelegt hat. 37. Welche unterschiedlichen Arten von Säulenchromatographie kennen Sie?

5 5 Z.B. Schwerkraft, Blitz, MPLC, HPLC. 38. Wie erkennt man, dass eine präparative Flashsäule bereit zur Trennung ist? Keine Blasen im Kieselgelbett, Säule ist äquilibriert (keine Wärmeemtwicklung mehr spürbar). 39. Wodurch unterscheiden sie sich HPLC und MPLC? Druckunterschied. 40. Wie bereitet man eine Probe für die HPLC vor? Es dürfen keine Feststoffe in der Lösung sein. Alle in der Lösung befindlichen Substanzen müssen von der Säule eluiert werden; möglichst im gleichen Eluens lösen, in dem die Analyse gestartet wird. 41. Wie geht man vor, um eine quantitative Analyse einer Substanz mit Hilfe der HPLC zu machen? Z. B. Eichgerade erstellen, mit internem oder externem Standard arbeiten. 42. Welche Form sollten die Peaks einer HPLC-Trennung idealerweise besitzen? Gausskurve. 43. Welche Anforderungen muss ein Laufmittel für die quantitative Analyse per HPLC erfüllen? Darf die Detektion nicht stören und darf mit der zu analysierenden Substanz nicht reagieren. 44. Was ist zu tun, wenn Ihnen bei einer Säulenchromatographie die Säule trocken läuft? Wie können Sie Ihre in der Säule befindliche Probe noch retten? Neu Eluens auftragen; wenn keine Trennung statt gefunden hat, alle Fraktionen vereinigen und Trennung erneut durchführen. 45. Kann man eine gepackte Säule auch wiederverwenden (für Trennung unterschiedlicher Substanzen)? Ja, aber auf verwendete Substanzen achten, dass diese vollständig eluiert wurden. 46. Wie entsorgt man die stationäre Phase nach einer Säulenchromatographie? Sondermüll, kontaminiertes Kieselgel, auf Gefährdung durch anhaftende Stoffe achten. 47. Welchen Vorteile hat die HPLC gegenüber der GC? Substanz wird nicht zerstört; präparativ anwendbar, für fast alle Substanzen (Größe) möglich.

6 6 48. Welche Problem tereten bei der Verwendung von Wasser als Eluens bei Kieselgelsäulen auf? Es wird Kieselsäure ausgeschwemmt. 49. Welche Druckbereiche gelten für die verschiedenen Arten der Flüssig-Chromatographie? Schwerkraft: Atmosphärendruck Blitz/Flash: 1-5 bar Mitteldruck: bar HPLC: bar, aber bis zu 1000 bar möglich 50. Welche Säulen sind bei der Analytischen HPLC im Prinzip besser? Dünne: hohe Konzentration am Detektor, geringe Substanzmengen, geringer Eluentsverbrauch. 51. Wie kann man farblose Substanze detektieren? UV, Brechungsindexänderung, opt. Drehung, Fluoreszenz, MS 52. Nennen Sie vier unterschiedliche Detektionsmethoden! MS, UV, Fluoreszenz, Brechungsindex 53. Wie ändern sich die Peaks bei höherer Temperatur bei der GC? Werden schärfer und rücken näher zusammen 54. Wie kann man die Totzeit bestimmen und mit welcher Substanz? Substanz einspritzen, die möglichst wenig mit der Säule wechselwirkt und gut detektierbar ist, z.b. Benzol bei Kieselgel 55. Wodurch kann Benzol ersetzt werden? Toluol, besser Gemisch aus Petrolether und Essigester 56. Warum kann Benzol nicht durch Cyclohexan ersetzt werden? Viskosität 57. Wie kann man eine gute Trennleistung bewirken? wenig viskose Lösungsmittel homogene Packung kleine Teilchen passende Fließgeschwindigkeit 58. Was muss bei der Wahl des Lösungsmittels bei präparativer Trennung beachtet werden?

7 7 Lösemittel mus entfernbar sein Lösemittel darf bei der Detektion nicht stören 59. Welche Vorteile hat die DC? Schnell und einfach; geringer Verbrauch von Lösemittel und Probe 60. Welche Nachteile hat die DC? Nur qualitative Analyse; keine Automatisierung, keine quantitative Analyse 61. Welche Vorteile hat die HPLC? Geringer Verbrauch von Probe und Eluens; Kopplung mit anderen Analysenmethoden möglich (z.b. HPLC-MS, HPLC-NMR); die Säule ist wiederverwendbar; Automatisierung möglich; quantitative und qualitative Analyse möglich 62. Nachteile der HPLC? Hohe Gerätekosten; saubere, speziell gereinigte Elutionsmittel; teure Säulen Literaturempfehlung: Veronica R. Meyer, Praxis der Hochleistungs-Flüssigchromatographie, 7. Aufl.,Verlag Sauerländer, Frankfurt/Main, 1992.

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