Analytische Chemie (für Biol. / Pharm. Wiss.)

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1 Analytische Chemie (für Biol. / Pharm. Wiss.) Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophorese) Dr. Martin Pabst HCI D323 Zusammenfassung der letzten Stunde: 1) Einteilung von Chromatographie-Techniken Mobiler Phase (LC u. GC) Stationärer Phase Verwendung 2) Grundlegende Formeln Chromatographie Verteilungskonstante K c : Retentionsfaktor k: Trennfaktor a: k = t R t M K C = c S c M = t R t M t R2 t M α = t R2 t M = = k 2 = K C 2 t R1 t M t R1 k 1 = K C V S V M K C1 = K C β Verteilung zwischen zwei Phasen Retention eines Peaks Relative Ret. zweier benachbarter Peaks 3) Peakform (Elutionsprofil der Analyten von der Säule) Gauss Peak (Mittelwert und Standardab., FWHM) 2

2 Skript ab S 25ff 1) Symmetrische Peakverbreiterung Einfluss auf Peakbreite Verbreiterung des Elutionsprofiles eines Analyten 2) Effizienz der Chromatographie Theoretische Böden van Deemter Kurve mehrere hundert Peaks!! 3 Abweichungen von der idealen Peakform (Gauss Peak) symmetrisch asymmetrisch übersättigen mobile Phase überladen stat. Phase Zeit t 4

3 Symmetrische Peakverbreiterung tailing factor a/b = 1 5 Einflüsse auf die Peakbreite Im Fall der idealen Peakform entspricht die Retentionszeit der mittleren Aufenthaltszeit der Moleküle eines Analyten in der Säule. Warum eluieren nicht alle Analyten zur exakt gleichen Zeit? 6

4 Wie entsteht der Gauss Peak? Damit sich das Gleichgewicht einstellen kann, muss ein Molekül mehrmals z.b.... innerhalb der mobilen Phase diffundieren, die Phasengrenze erreichen, die Phasengrenze überqueren, in der stationären Phase diffundieren (GC), die Phasengrenze erreichen, die Phasengrenze durchqueren, usw. Die Geschwindigkeiten der einzelnen Prozesse sind für jedes Molekül zufällig verschieden! 7 Wie entsteht der Gauss Peak? Manche Moleküle sind also zufällig schneller, manche zufällig langsamer als die Moleküle, welche exakt bei der für den Analyten typischen Retentionszeit die Säule verlassen. Positive und negative Abweichungen von der Retentionszeit mitteln sich im Idealfall heraus. Die Aufenthaltszeiten der einzelnen Moleküle sind symmetrisch um die Retentionszeit verteilt. folglich ergibt sich ein Gauss Peak! 8

5 Aufgliederung der Einflüsse auf die Peakbreite: Peakverbreiternde Prozesse sind: 1) Eddy-Diffusion 2) Longitudinaldiffusion 3) Massentransport-Effekte (Stofftransport-Effekte) 9 Eddy-Diffusion Peakverbreiterung aufgrund von Weglängenunterschieden einzelner Moleküle in gepackten Säulen aus: chemgapedia -- Grundlagen der Chromatographie 10

6 Longitudinaldiffusion Peakverbreiterung durch Diffusion der Analytenmokeküle in der mobilen Phase Nur der longitudinale Anteil (entlang oder entgegen der Strömungsrichtung) ist von Bedeutung aus: chemgapedia -- Grundlagen der Chromatographie 11 Massentransport-Effekte Peakverbreiterung aufgrund von Geschwindigkeitsunterschieden im Stofftransport von individuellen Molekülen (z.b. Diffusion der Analyten in der mobilen Phase, Übergang zwischen mobiler und stationärer Phase) aus: chemgapedia -- Grundlagen der Chromatographie 12

7 Modell der theoretischen Böden = Effizienz einer Trennung 13 Modell der theoretischen Böden Ein theoretischer Boden ist jene theoretische räumliche Einheit einer Trennsäule in der sich zumindest einmal das Nernst- Gleichgewicht einstellen kann! Je mehr theoretische Böden, desto mehr Gleichgewichtseinstellungen! 14

8 Theoretische Böden Anzahl der theoretischen Böden N: N = t R t = 16 R t = 5.54 R σ w b w 1/ 2 Die Bodenzahl N hängt von der Retentionszeit eines Peaks und dessen Breite ab. Je breiter ein Peak, desto ineffizienter die Trennung. Bodenhöhe H: H = L N H ist besser geeignet als N um Säulen verschiedener Länge L miteinander zu vergleichen Je mehr theoretische Böden (N) oder je kleiner die Bodenhöhe (H), desto höher die Effizienz der Trennung! 15 Die van-deemter-gleichung H = A + B u +C u Beiträge von A: Eddy-Diffusion B: Longitudinaldiffusion C: Massentransport-Effekte Die van-deemter-gleichung beschreibt die Effizienz einer Trennung bzw. die Bodenhöhe H als Funktion der Lineargeschwindigkeit u. Je grösser A, B und C, desto ineffizienter die Trennung. Die Trenneffizienz hat bei der Lineargeschwindigkeit u ein Optimum, bei der H minimal wird. 16

9 Die van-deemter-gleichung H = A + B u +C u Beiträge von A: Eddy-Diffusion B: Longitudinaldiffusion C: Massentransport-Effekte 17 A-Term: Eddy-Diffusion Verringerung der Effizienz aufgrund unterschiedlicher Weglängen der Analyten in einer gepackten Säule. Unabhängig von der Lineargeschwindigkeit u. Als Funktion von u ergibt der A-Term eine zur x-achse parallele Gerade. LC: arbeitet mit gepackten Säulen, der A-Term ist hier also von Bedeutung. GC: ist nur bei gepackten Säulen von Bedeutung, kann bei den meistens eingesetzten Kapillarsäulen vernachlässigt werden. A-Term Konstanter Einfluss, abhängig von Material und Beschaffenheit der stat. Phase 18

10 B-Term: Longitudinaldiffusion Verringerung der Effizienz aufgrund der Diffusion der Analyten in der mobilen Phase (nur der longitudinale Anteil hat einen Einfluss). B-Term = B x u Hyperbel Je grösser der Diffusionskoeffizient des Analyten in der mobilen Phase (D M ), desto grösser B: B D M LC: Kleine Diffusionskoeffizienten (D M < 10-5 cm 2 s -1 ) in Flüssigkeiten, deshalb geringer Einfluss von B. GC: Grosse Diffusionskoeffizienten (DM 10-1 cm2 s-1) in Gasen, deshalb starker Beitrag von B an der Peakverbreiterung. Indirekte Proportionalität, da bei langer Aufenthaltszeit der Moleküle in der Säule die Peakverbreiterung durch Diffusion grösser wird. 19 C-Term: Massentransport-Effekte Verringerung der Effizienz aufgrund von Unterschieden in der Stofftransportgeschwindigkeit C-Term = Cu Gerade C u = C S u +C M u CS, CM: Beiträge von stationärer und mobiler Phase LC: C S spielt bei gepackten Säulen keine Rolle GC: bei Kapillarsäulen sind C S und C M von Bedeutung C S d S D S = C u C M u C M 1 D M Schichtdicke stat. Phase Diffusionskoeffizient in stat. Phase C M 1 D M Direkte Proportionalität, da bei geringerer Geschwindigkeit u mehr Zeit für den Ablauf der Stofftransportprozesse bzw. zur Gleichgewichtseinstellung zur Verfügung steht. 20

11 Van-Deemter-Gleichung Typische Verläufe für LC und GC LC schmales Optimum breites Optimum GC A = const. A = 0 B D M (D M < 10-5 cm 2 s -1 ) B D M (D M 10-1 cm 2 s -1 ) C u C M u C M 1 D M C S d S D S C M 1 D M Gase mit grossem D M bevorzugt (H 2, He) 21 Anzahl theoret. Böden N, Bodenhöhe H Tab. 1: Typische Bodenzahlen N und Bodenhöhen H gängiger Säulen in der Gaschromatographie (GC) und Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) sowie typische Säulenparameter. Säulentyp N (pro Säule) H (mm ) GC Kapillarsäulen (25 m) 0.1 mm Innendurchmesser 0.5 mm Innendurchmesser gepackte Säulen (1-3 m) HPLC gepackte Säulen (25 cm) 10 µm-partikel 3 µm-partikel

12 Anzahl theoret. Böden N, Bodenhöhe H Tab. 2: Optimale und in der Praxis eingesetzte Lineargeschwindigkeiten und Flussraten in der Gaschromatographie (GC) und Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) Technik / Säule GC Lineargeschwindigkeit [cm s -1 ] Flussrate (Volumenstrom) [ml min -1 ] Optimum In der Praxis Optimum In der Praxis Kapillarsäule (0.25 mm Innendurchmesser) gepackte Säule (4 mm Innendurchmesser) HPLC gepackte Säule (4.6 mm Innendurchmesser)

H = A + B u +C u. Analytische Chemie (für Biol. / Pharm. Wiss.) Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophorese)

H = A + B u +C u. Analytische Chemie (für Biol. / Pharm. Wiss.) Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophorese) Analytische Chemie (für Biol. / Pharm. Wiss.) Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophorese) Dr. Martin Pabst HCI D323 Martin.pabst@org.chem.ethz.ch http://www.analytik.ethz.ch/ Zusammenfassung

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