Versuchsprotokoll: Chromatographie. Gelchromatographische Trennung eines Proteingemischs

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1 Versuchsprotokoll: Chromatographie Gelchromatographische Trennung eines Proteingemischs 1.1. Einleitung Das Ziel der Gelchromatographie ist es ein vorhandenes Proteingemisch in die einzelnen Proteine zu trennen. Anhand verschiedener Volumina kann dann der Verteilungskoeffizient für jedes Protein bestimmt werden. Um diese zu bestimmen, bedienen wir uns wie auch schon im Versuch I einem Photometer, um die maximale Konzentration der Proteine in den verschiedenen Fraktionen zu bestimmen. Die Fraktion mit der höchsten Konzentration wird dann zur Berechnung des Verteilungskoeffizienten K genutzt. Auch die Proteinbestimmung nach Lowry wird erneut angewendet Material und Methode Die in diesem Versuchsteil zu benutzenden Materialien sind im Skript auf Seite 6 unter Reagenzien angegeben. Wie unter 1.1. schon beschrieben, benutzen wir für die Trennung der Proteine eine Gelchromatographie. Die verschiedenen Proteine werden anhand ihrer Größe getrennt. Es handelt sich hiermit um eine Ausschluß- oder Molekularsiebchromatographie. Man spricht auch von Gelfiltration oder Gelchromatographie. Bei dieser Art von Chromatographie spielt hauptsächlich die Diffusion von Teilchen eine Rolle. Wechselwirkungen zwischen Molekülen und Gruppen sowie Adsorption und Affinitäten sind nicht beteiligt. Das Prinzip ist sehr einfach: Proteinmoleküle mit einer kleinen Radius können in die Kügelchen des Gels eindringen und müssen im Gegensatz zu Molekülen mit großem Radius ein größeres Volumen durchlaufen. Somit benötigen die kleinen Moleküle länger, um durch die gesamte Säule zu eluieren. Nutzt man diesen zeitlichen Faktor aus und fängt Fraktionen von 3 ml auf, kann man die maximale Konzentration per Photometrie anhand der Extinktion bestimmen. Hat man die Fraktion mit der höchsten Konzentration eines Proteins ermittelt, kann man den Verteilungskoeffizienten für dieses Protein anhand folgender Gleichung bestimmen: K = V el V 0 / V t V 0, da V el = V 0 + K * V i Der Verteilungskoeffizient K nimmt einen Wert zwischen 0 und 1 an. Der Verteilungskoeffizient K macht somit eine Aussage über die Molekülgröße. Ist K klein, so ist das Molekül groß. V 0 ist das Volumen, das sich außerhalb der Gelkugeln in der Säule befindet. V i ist das Volumen im Inneren der Gelkugeln. 1

2 Sehr große Moleküle können, wie oben bereits erwähnt, nicht in die Gelkugeln eindringen. Sie befinden sich also ausschließlich in V 0. Ist nun eine Menge von V 0 durch die Säule gelaufen, müsste theoretisch die Gesamtheit der großen Moleküle eluiert sein. V i spielt deshalb keine Rolle. K ist in diesem Fall null. Sehr kleine Moleküle können zusätzlich in das Innere der Gelkugeln eindringen. Deswegen muss man V i berücksichtigen. Da die Moleküle theoretisch in alle Gelkugeln eindringen ist K gleich 1, da V el = V 0 + V i. Für die Bestimmung der Extinktion des Rinderserumalbumins wird der Nachweis von Proteinen nach Lowry durchgeführt. Dieser Vorgang wurde bereits in Versuchsprotokoll I: Aminosäure- und Proteinbestimmung aufgezeigt Versuchdurchführung Siehe Skript! Änderung: Das Volumen der Fraktionen wurde auf 3ml erhöht! 1.4. Versuchsergebnisse Dextran bei 578 nm Probe Volumen in ml Extinktion 0 0,005 0,045 0,125 0,05 0,015 0,005 0,005 Cytochrom c bei 436nm Probe Volumen in ml Extinktion 0,01 0,03 0,045 0,075 0,095 0,14 0,175 0,165 0,12 0,09 0,08 0,07 0,045 Rinderserumalbumin bei 578nm mit Lowry Probe Volumen in ml Extinktion 0,001 0,001 0,01 0,065 0,06 0,025 0,009 Chromat bei 366nm Probe Volumen in ml Extinktion 0,68 0,85 0,89 0,57 2

3 Extinktion der Proteinfraktionen 0,9 0,8 0,7 0,6 Extinktion 0,5 0,4 0,3 0,2 0, Volumina des Eluats in ml Dextran Cytochrom c Rinderserumalbumin Chromat Berechnung der Verteilungskoeffizienten: V el = V 0 + K * V i, V T = V 0 + V i K = (V el V 0 ) / (V T V 0 ) Das Volumen V 0 beträgt für alle Berechnungen 27 ml. V T ist das Totalvolumen, das durch die Säule gelaufen ist. Man kann zwei verschiedene V T bestimmen. Einmal kann man das Säulenvolumen als V T festlegen, da man davon ausgehen kann, dass beim Durchlaufen des gesamten Volumens der Säule alle Moleküle eluiert sind. Das Säulenvolumen beträgt: Säulendurchmesser = 1,5 cm Säulenradius = 0,75 cm Gelhöhe = 36,5 cm Säulenvolumen = πr 2 * h = 36,5cm * π * 0,75 2 cm² = 64,5cm³ = 64,5ml Andererseits kann man als V T auch das gesamte Volumen der Fraktionen nehmen. V T = 78 ml (Maximum von Chromat) Dextran: bei Probe 9 = 27 ml = = V el K = (27 ml 27ml ) / (64,5ml 27ml ) = 0 (V T = Säulenvolumen) K = (27ml 27ml ) / (78 ml 27ml ) = 0 (V T = eluiertes Gesamtvolumen) 3

4 Cytochrom c: bei Probe 21 = 63 ml = = V el K = (63ml 27ml) / (64,5ml 27ml) = 0.96 (V T = Säulenvolumen) K = (63ml 27ml) / (78ml 27ml) = 0,705 (V T = eluiertes Gesamtvolumen) Rinderserumalbumin: bei Probe 14 = 42 ml = V el K = (42ml 27ml) / (64,5ml 27ml) = 0,4 (V T = Säulenvolumen) K = (42ml 27ml) / (78ml 27ml) = 0,29 (V T = eluiertes Gesamtvolumen) Chromat: bei Probe 26 = 78 ml = V el K = (78ml 27ml) / (64,5ml 27ml) = 1,36 (V T = Säulenvolumen) K = (78ml 27ml) / (78ml 27ml) = 1 (V T = eluiertes Gesamtvolumen) 1.5. Auswertung Wie unter Punkt 1.3. beschrieben liegt der Verteilungskoeffizient K immer zwischen 0 und 1, wenn man als V T = eluiertes Gesamtvolumen einsetzt. Nimmt man als V T = Säulenvolumen so führt dies zu einem Verteilungskoeffizienten K, der sich von dem Verteilungskoeffizienten, welcher V T = eluiertes Gesamtvolumen berechnet wurde, unterscheidet. Jedoch ist klar feststellbar, dass auch diese Verteilungskoeffizienten mit der Molekülgröße umgekehrt proportional sind. Dass das Chromat eine Verteilungskoeffizienten von 1,36 (bei V T = Säulenvolumen) aufweist, liegt wohl daran, dass wohl Wechselwirkungen des Chromat in Kraft treten, die die Durchlaufzeit noch weiter verlangsamen. Die restliche Betrachtung der Versuchsergebnisse konzentriert sich ausschließlich auf die Berechnung mit V T = eluiertes Gesamtvolumen. Der Verteilungskoeffizient für das Dextran ist somit null. Dies entspricht der Theorie, dass die großen Moleküle nicht in das innere Volumen Vi eindringen können. Auch der Verteilungskoeffizient von Chromat, der bei K = 1 liegt, entspricht der Theorie, dass die kleinen Moleküle, das gesamte Säulenvolumen einnehmen können. Vergleicht man die Größe der obigen Moleküle mit deren K- Wert, so zeigt sich, dass der Verteilungskoeffizient K eine Aussage über die Molekülgröße macht. Je kleiner K, desto größer ist das Molekül. Auch das obige Diagramm zeigt diese Eigenschaft auf. Die verschiedenen Moleküle eluieren in einer zeitlichen Abfolge, wobei natürlich auch Überschneidungen zu beobachten sind Zusammenfassung/Diskussion Durch die Gelfiltration kann man ein Gemisch aus Molekülen verschiedener Größe trennen. Der Verteilungskoeffizient K macht eine Aussage über die Molekülgröße. 4

5 Nimmt man als V T den theoretischen Wert, also das Säulenvolumen, kommen nicht definierte K-Werte vor. Somit kann man feststellen, dass die Diffusionseigenschaften der Moleküle nicht theoretisch zu betrachten sind. Dies zeigt auch der Verteilungskoeffizient von Chromat, der theoretisch 1 betragen müsste. Der Wert für K liegt jedoch nur bei 1,36. 5

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