Vom Molekül zur Zelle Block 3 Seminar / Praktikum 1

Transkript

1 Vom Molekül zur Zelle Block 3 Seminar / Praktikum 1 Diese Präsentation befindet sich auf der Homepage: Helmut Dolznig, Ass. Prof. PD Mag. Dr. Universität Wien Ernst Müllner Max F. Perutz Laboratories (MFPL) Department für Biochemie Universität Wien

2 Literatur Ergänzung der theoretischen Grundlagen und biochemisches Praktikum im Block 3 - vom Molekül zur Zelle Facultas Verlag Hans Goldenberg (Hg.) Zellbiologie, Wiley - Verlag Chemie Bruce Alberts ergänzend z.b. Chemie erleben (Abschnitt Analytische Chemie ), Facultas - Universitäts Taschenbuch Verlag Edgar Wawra, Helmut Dolznig, Ernst Müllner

3 Der praktische Teil der 1. Übung findet statt am: Zentrum für Pathobiochemie & Währingerstraße 10 Übungssaal III (Tiefparterre)

4 Trennmethoden Dünnschichtchromatographie Ionenaustauschchromatographie Reversed Phase Chomatography (apolare stationäre Phase, polares Elutionsmittel = mobile Phase) Gaschromatographie Gelfiltration (Größenausschluss Chromatographie) Elektrophorese Affinitätschromatographie

5 Säulenchromatographie

6 Ionenaustauscher: z.b. Austausch der Na + -Ionen gegen Ca ++ -Ionen, anschließend Elution von Ca ++ mit Lösung mit hoher Na + -Konzentration Ka#onenaustauscher Anionenaustauscher Abb. aus Chemie erleben ; Wawra, Dolznig und Müllner, Facultas / UTB Verlag, 2010

7 Affinitätschromatographie: z.b. Reinigung eines Enzyms aus einer komplexen Mischung von Proteinen Abb. aus Chemie erleben ; Wawra, Dolznig und Müllner, Facultas / UTB Verlag, 2010

8 Praktikumsbeispiel 1 Trennung von Aminosäuren mittels Dünnschichtchromatographie (nach ihrer Polarität, Verteilungschromatographie)

9 Auftragen der Proben Glasröhrchen Zellulose auf Alufolie, polar, stationäre Phase Standard = Referenzwert

10 Auftragen der Proben

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12 Dünschicht- Chromatographiefolie in Glastrog mit Laufmittel stellen Wanderungsrichtung der Proben Laufmittel, unpolar, mobile Phase 35% Azeton / 35% n-butanol in Acetatpuffer

13 Dünnschichtchromatographie Trog Chemie erleben Wawra et al. gelber Farbstoff = Isatin

14 nach circa 2 Stunden:

15 Markieren der Front Start

16 Front Wanderungsstrecke der Aminosäure W(as) Wanderungsstrecke der mobilen Phase W(m) Start

17 Dünschichtchromatogramm nach der Färbung / Trocknung

18 Auswertung W(as) W(m) = Rf(as) Rf = Retentionsfaktor Chemie erleben, Wawra et al. Nernstscher Verteilungssatz Verteilungskoeffizient c = [Aminosäure] mobile Phase [Aminosäure] stationäre Phase

19 Nernstscher Verteilungssatz Beschreibt die Verteilung eines Stoffes zwischen zwei miteinander nicht mischbaren Phasen (z.b. gasförmig / flüssig oder flüssig / fest oder flüssig / flüssig). [Br 2 ] Wasser Verteilungskoeffizient c = [Br2 ] Chloroform Chemie erleben Wawra et al.

20 Praktikumsbeispiel 2 Gelfiltration Trennung der Moleküle nach ihrer Größe

21 Gelfiltration große Poren und Kapillaren kleine Moleküle können hinein, haben dadurch einen längeren Weg zurückzulegen als die großen, (die außen herum schwimmen) und kommen daher später aus der Säule heraus. kleine Moleküle Fraktionen

22 Trennung eines Dextranblau / Methylrot Gemisches mittels Gelfiltration Sephadex G25 Säulenmaterial in Elutionspuffer äquilibriert. 0.5 ml der Probe (Dextranblau und Methylrot) direkt auf die gerade trockengelaufene Glasfritte auftragen. Wenn vollkommen ins Säulenmaterial eingedrungen, mit ca. 5 ml Elutionspuffer nachspülen, 3 mal wiederholen. Austretender Elutionspuffer wird in Fraktionen zu je 20 Tropfen (= ca. 1 ml) gesammelt. Um Methylrot sichtbar zu machen, Fraktionen mit je 1 Tropfen HCl ansäuern. Dextranblau ist blau gefärbt.

23 Reagenzien für die Gelfiltration Elutionspuffer in Dispenserflasche Dextransblau / Methylrot Farbstoffmischung Salzsäure (HCl) zum Ansäuern und Entwickeln der Rotfärbung von Methylrot

24 Gelfiltration Sammeln der Fraktionen Chemie erleben, Wawra et al.

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26 Schema der Trennung eines Dextranblau / Methylrot Gemisches mittels Gelfiltration Farbintensität Fraktionen Dextranblau: Methylrot: großes Molekül, eluiert zuerst kleines Molekül, kommt später aus der Säule heraus

27 Praktikumsbeispiel 3 Elektrophorese

28 Prinzip der Elektrophorese Trennung von geladenen Molekülen im elektrischen Feld

29 Trennung und quantitative Analyse der Serumproteine Voraussetzungen: Serumproteine müssen positiv oder negativ geladen sein. richtige Wahl des Puffers! Trägermaterial (analog zur stationären Phase) Gleichstromquelle

30 Elektrophorese Apparatur

31 pipettieren kleiner Volumina mit automatische Pipetten

32 Elektrophorese - Probenvorbereitung

33 + Anode Tröge mit Pufferlösung Cellogel, Trägermaterial Kathode Platin Elektroden Gleichstromquelle

34 Welchen ph-wert muss die Pufferlösung haben, wenn alle Proteine zur Anode wandern sollen? Der isoelektrische Punkt (p I ) der Serumproteine ist ~ 5. Daher muss der ph des Puffer >5 sein (in der Praxis bei etwa ph = 9), damit ALLE Proteine negativ geladen werden... Chemie erleben, Wawra et al.... ansonsten würden der Anteil an positiv geladenen Proteinen zur Kathode wandern

35 + Anode negativ geladene Proteine (Anionen) wandern zur positiv geladenen Anode Wanderungsrichtung Proben Kathode 250V 30 min Gleichstromquelle Standard Serum

36 Gleichstromquelle: 250 V

37 Nach der Elektrophorese Färben der Proteine Trägermaterial durchsichtig machen Photometrische (densitometrische) Auswertung Messen der Farbstoffdichte entlang des Trägermaterials

38 aufgetrennte Serumproteine

39 Elektrophorese von Serumproteinen Chemie erleben Wawra et al.

40 Das Prinzip der Auswertung... Fläche ist proportional der Farbmenge, also auch der Proteinmenge Detektor Probe wird am Detektor vorbeigezogen Lichtquelle

41 ... beruht auf dem Lambert-Beerschen Gesetz E = ε x c x d E = Extinktion ε = spez. molarer Extinktionskoeffizient c = Konzentration d = Schichtdicke (in cm) E = log (1/T) = log (I 0 /I) I 0 I Photozelle Lichtquelle Prisma Detektor Küvette mit Probe d = 1 cm

42 verwendetes Densitometer (ein Typ von Photometer)

43 Ausdruck der Ergebnisse

44 diagnostische Aussagemöglichkeiten (Beispiele) aus: Ergänzung der theoretischen Grundlagen, H. Goldenberg, (Hg.) für eine ausführlichere Darstellung siehe z.b. laborbefunde/ lbef_ephorese_ eiweiss.htm

45 Protokoll zur Bewertung der Ergebnisse

46 Zwischenfrage: Warum gibt es im Blut mehr Kationen, wie Na +, K +, Ca ++, Mg ++ als Anionen, wie Cl - oder HCO 3 -? Weil die Anionenlücke durch die negative Ladung der Proteine bei ph 7.4 ausgeglichen wird.

47 Globuline α 1 -Globulin: Transcortin (Steroid-Transport) Transcobalamin (Vitamin B 12 -bindend) Thyroxin-bindendes Globulin Bilirubin-Transporter Prothrombin (Proenzym des Thrombins) Gc-Globulin (Vitamin D-bindend) α1-antitrypsin α 2 -Globuline Haptoglobin: Hämoglobinbindung Caeruloplasmin: Transport von Cu-Ionen β-globuline Beta-Lipoproteine: Lipidtransport Transferrin: Eisentransport Fibrinogen: Vorstufe von Fibrin Hämopexin: Häminbindung und transport C-reaktives Protein: Akute Phase Protein Plasminogen γ-globuline Immunglobuline (Antikörper) (IgA, IgD IgE, IgG, IgM)