Laborprotokoll. Trennung von Chlorophyll a und Chlorophyll b mittels Säulenchromatographie

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1 Laborprotokoll Trennung von Chlorophyll a und Chlorophyll b mittels Säulenchromatographie Cédric Birrer (E46) Michel Rickhaus (E45) Anna-Caterina Senn (E44) Juni 2007

2 Inhaltsverzeichnis 1 Versuchsziel Versuchsaufbau Apparativer Aufbau des Versuches A Extraktion des Blattfarbstoffes B Dünnschichtchromatographie C Präperative Trennung mit Säulenchromatographie Verwendete Substanzen Versuchsablauf A Extraktion des Chlorophylls aus Spinat B Dünnschichtchromatographie C Präparative Trennung mit Säulenchromatographie Ergebnisse Diskussion... 5 i

3 1 Versuchsziel In diesem analytischen Versuch geht es darum, aus Spinat Chlorophyll a und Chlorophyll b zu extrahieren, und diese in einem zweiten Schritt mittels Säulenchromatographie voneinander zu trennen. Durch ein optimales Mischungsverhältnis von Petrolether und Aceton als Lauf- und Extraktionsmittel sollen sich die einzeilnen Chlorophyllkomponenten möglichst deutlich trennen lassen. Der Auftrennung der Blattfarbstoffe liegt ein Polaritätsunterschied zu Grunde. Das Chlorophyll b besitzt einen Aldehydrest, wo das Chlorophyll a einen Methylrest aufweist. Somit ist ersteres polarer. Die unterschiedliche Polarität von verschiedenen Stoffen macht sich die Säulen- sowie die Dünnschichtchromatographie zu nutze, um die einzelnen Stoffe voneinander zu trennen. 1

4 2 Versuchsaufbau 2.1 Apparativer Aufbau des Versuches A Extraktion des Blattfarbstoffes Porzellanmörser mit Pistill, kleiner Scheidetrichter B Dünnschichtchromatographie Silicia-DC-Plättchen, 3 Tennkammern mit Kammersättigung, Glaskapillaren C Präperative Trennung mit Säulenchromatographie Stativ mit Klammern, Chromatographierohr mit Glasfritte und Hahn, Reagenzgläser mit Reagenzglasständer, 2-3 kleine Rundkolben NS, Rotationsverdampfer, Silicia-DC-Plättchen, Glaskapillaren Vorbereitung: Für die Säulenchromatogrphie wurde das Vorgehen leicht abgeändert. So wurde in die Verjüngung am Chromatographierohr keine Glaswatte gedrückt, sonder es wurde ein Rohr mit Glasfritten verwendet. Das Silicia wurde vor dem Einfüllen ins Rohr in einem grossen Becherglas mit dem Laufmittel (Aceton / Petrolether: 1:4) angerührt und erst anschliessend in die Säule gefüllt. Die luftblasenfreie Sedimentation des Silicias erreicht man mit leichtem Klopfen gegen die senkrecht befestigte Glassäule. Nun wurde das Niveau des darüberstehenden Laufmittels durch Öffnen des Hahns bis genau auf die Höhe der Siliciaschicht herabgesetzt. Die Chlorophylllösung wurde vorsichtig mit einer Pasteur- Pipette darüber geschichtet. Nun wurde das Flüssigkeitsniveau erneut auf die Höhe des Silicias abgesenkt und darauf eine 1-2 cm dicke Schicht Quarzsand gegeben. Diese soll beim Auffüllen der Säule mit Laufmittel das Aufwirbeln der Silicia-Schicht und Probelösung verhindern. 2

5 2.2 Verwendete Substanzen Spinatblätter (frisch) Quarzsand: gereinigter Sand Aceton: Strukturformel Andere Namen Propanon, Dimethylketon Summenformel C 3 H 6 O Funktionelle Gruppe Keton (C=O) Kurzbeschreibung Farblose Flüssigkeit Eigenschaften Molmasse g/mol Aggregatzustand flüssig Dichte g/cm 3 Smp -95 C Löslichkeit Org. Lsm., Wasser Sdp 56 C Gefahrenhinweise R-Sätze S-Sätze F Xi (2) Petrolether: farbloses Gemisch verschiedener, gesättigter Kohlenwasserstoffe (üblicherweise Alkane wie Pentan/Hexan), das leichtflüchtig und entzündlich ist. Silica gel: Allgemeines Gefahrenhinweise Summenformel SiO 2 + H 2 O+ CoCl 2 Gesundheitsschädlich Molmasse g/mol beim Kurzbeschreibung weisser Puder Einatmen Eigenschaften stark hygroskopisch Xn 3

6 3 Versuchsablauf 3.1 A Extraktion des Chlorophylls aus Spinat 2g frischer Blattspinat wurde in der Reibschale mit 1g Quarzsand, 5ml Aceton und 5ml Petrolether während 10min zerrieben. Anschliessend wurde das grüne Gemisch dekantiert um die festkörper abzuscheiden. Die phasenbildende Lösung wurde in einen Scheidetrichter gegossen und die kräftig dunkelgrüne, klare organische Lösung abgetrennt. 3.2 B Dünnschichtchromatographie Von der erhaltenen farbstoffreichen organischen Lösung wurde als mobile Phase je eine geringe Menge auf drei DC-Plättchen aufgetragen. Dieser Versuch dient der Erruierung des optimalsten Laufmittels für die Säulenchromatographie. Deshalb wurden bei dieser DC drei verschiedene Zusammensetzungen des Laufmittels gewählt, die sich hauptsächlich in ihrer Polarität unterscheiden: DC1: Aceton / Petrolether 1 : 3 DC2: Aceton / Petrolether 1 : 4 DC3: Aceton / Petrolether 1 : 5 Die Auswertung der DC's zeigt, dass sich der grüne Farbstoff aus etlichen Bestandteilen zusammensetzt. Dies ist nicht erstaunlich, da es sich um ein Pflanzenextrakt handelt. Die beste Trennung von Chlorophyll a und Chlorophyll b erhielt man mit dem Laufmittel der DC2. Dieses wurde dann im Folgenden auch als Laufmittel für die Säulenchromatographie verwendet. 3.3 C Präparative Trennung mit Säulenchromatographie Die Apparatur wurde nach Kapitel aufgebaut und die Säulenchromatographie durch öffnen des Hahns in Gang gesetzt. Es wurde darauf geachtet, dass das Silicia niemals trocken läuft! Der Ausfluss wurde in Reakenzgläsern aufgefangen, so dass sich pro Fraktion 2-3 cm Flüssigkeit in einem Reagenzglas sammelten. Das Chlorophyllgemisch trennte sich auf (siehe Abb). So erhielt man 18 gefärbte Fraktionen, wobei man nach und nach die Polarität des Laufmittels etwas erhöhte. 4

7 Anschliessend wurden alle Fraktionen der gleichen Farbe und somit des mehr oder weniger gleichen Stoffinhalts in je einem kleinen Rundkolben zusammen gegossen. Es entstanden so 3 Hauptfraktionen: Hauptfraktion: Enthält Reagenzläser: Farbe dunkelgelb dunkelgrün hellgrün / -gelb Diese wurden am Rotationsverdampfer zur Trockenheit eingeengt. Als Rückstand blieben feine Spuren der reinen Farbstoffe in den Kolben zurück. 4 Ergebnisse Durch die säulenchromatographische Trennung der extrahierten Chlorophyll-Lösung erhielt man diverse Fraktionen mit unterschiedlichen Farbnuancen. Eine saubere, klare Trennung von Chlorophyll a und Chlorophyll b ist so jedoch nicht möglich. 5 Diskussion Um zu kontrollieren, welche Stoffe jeweils in den 18 verschiedenen Fraktionen noch enthalten sind, wurde eine Dünnschichtchromatographie durchgeführt. Auf einer DC- Platte wurden Proben aller 18 Fraktionen aufgetragen, diese wurde dann in eine Trennkammer mit dem Laufmittel der Säulenchromatographie gestellt. So wurde nun bewiesen, was schon befürchtet wurde: Selbst die einzelnen Fraktionen sind immer noch Gemische aus verschiedenen Farbstoffen. Es gelang also keine saubere Auftrennung. Mann könnte die Ergebnisse verbessern, würde man zum Beispiel eine längere Säule nehmen, oder das Laufmittel noch optimaler wählen. 5