Dünnschichtchromatographie (DC) und Säulenchromatographie Kurzanleitung
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- Lena Pfaff
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1 Dünnschichtchromatographie (DC) und Säulenchromatographie Kurzanleitung Sebastian Meiss 24. Oktober
2 1 Dünnschichtchromatographie Vorbereitung Gemisch fest Gemisch in möglichst wenig Lösungsmittel (Gemisch aus polarem und unpolarem Lösungsmittel (z.b. Essigester und n-hexan)) lösen, indem zunächst ein Lösungsmittel zugegeben wird und der nicht gelöste Anteil dann durch Zugabe des zweiten Lösungsmittels gelöst wird. Gemisch flüssig Alles bestens. DC-Platten zurechtschneiden (4cm breit, 7 cm lang für mehrere Proben, schmaler für eine Probe (so bei der Vorprobe) Bei der Dünnschichtchromatographie trägt man die zu untersuchende Substanz auf eine DC-Platte auf, indem man auf dieser Platte ca. 1 cm über dem unteren Rand einen Bleistiftstrich zieht und darauf Punkte markiert, auf denen man die Substanz(en) aufträgt. Möchte man nur eine Vorprobe für eine Säulenchromatographie machen, so setzt man nur einen Punkt(Platte siehe Abbildung 1a). Auf die Punkte tüpfelt man die Probensubstanz(Gemisch, flüssig!!) mit einer Kapillare auf. Unter der UV-Lampe kann man prüfen, ob ausreichend Substanz vorhanden ist(die Substanz wird hier als rosa Punkte sichtbar, siehe auch spätere Abbildungen). Beim Auftüpfeln stets warten, bis das Lösungsmittel wieder verdampft ist, damit man keine großen Lösungsmittelflecken auf der Platte produziert! Abbildung 1: DC-Platte vor (a) und nach der Chromatographie (b) Nun wird die Platte in die DC-Kammer gestellt, in welcher sich ein Laufmittel befinden muss (ca. 10mL). Während des Laufprozesses darf die Kammer nicht bewegt werden! Das Laufmittel zieht nun durch die Platte. Man nimmt die Platte aus dem Laufmittel, wenn dieses sich etwa 1cm unter dem oberen Rand befindet. Wichtig: Man benötigt eine ausreichende Laufstrecke, sonst kann man die Ergebnisse nicht gescheit auswerten! Unmittelbar nach dem Entnehmen zieht man einen Strich, um zu markieren, wie weit das Laufmittel gelaufen ist (Laufmittelfront; Abb. 1b). 2
3 Die Dünnschichtchromatographie kann als Vorprobe vor einer Säulenchromatagraphie eingesetzt werden, um zu bestimmen, welches Laufmittel optimal ist. Wir haben hier ein Laufmittel verwendet, das ein Gemisch aus Essigester (Essigsäureethylester) und n-hexan in verschiedenen Mischungsverhältnissen darstellt. Die Mischungverhältnisse waren: Stoff V [ml] A B C D n-hexan Essigester Wahl des Laufmittels Wie aus den Bildern in Abbildung 2 zu erkennen ist, gibt es Laufmittel, die für eine Fraktionierung der einzelnen Substanzen geeigneter sind als andere. Da bei mehreren Substanzen (unterschiedliche Polarität) niemals ein Laufmittel gefunden werden kann, dass für jede Einzelsubstanz optimale R f -Werte( siehe Seite 4, Abschnitt Auswertung) liefert, muss ein Kompromiss geschlossen werden. Ein eher unpolares Laufmittel ist dann geeignet, wenn es den polarsten Stoff noch mitschwämmt aber den unpolarsten nicht zu weit zur Laufmittelfront mitnimmt (umgekehrtes gilt für ein polares Laufmittel). Zudem müssen die einzelnen Substanzen deutlich voneinander getrennt auf der DC-Platte liegen. Sie dürfen also nicht ineinander überfließen, sondern müssen als einzelne, abgegrenzte Flecken im UV-Licht zu sehen sein. In Abbildung 2a sind die einzelnen Punkte am oberen Rand verschmiert und außerdem die Punkte sehr weit oben (Hoher R f -Wert). Die dritte Substanz ist hingegen überhaupt nicht gelaufen. Dieses Laufmittel eignet sich daher nicht für eine Trennung des Gemischs. In Abbildung 2b hingegen sind die ersten beiden Punkte mit Abstand aufgetrennt und der erste nicht so weit gelaufen (brauchbarer R f -Wert). Außerdem ist auch die dritte Substanz gelaufen, zwar nur wenig, aber es ist möglich die Substanz aus einer Säule auszuschwämmen. Abbildung 2: Ungeeignetes Laufmittel (a) und geeignetes Laufmittel (b) 3
4 Abbildung 3: Ermitteln des R f - Wertes Auswertung Man wertet eine Dünnschichtchromatographie aus, indem man für jede im Gemisch enthaltene Substanz der sog. R f -Wert bestimmt. Dieser Wert (Reaktionsfaktor) gibt an, wie schnell sich eine Substanz mit dem Laufmittel mitreißen lässt und wie schnell es somit bei einer Säulenchromatographie durch die Säule gelaufen ist. Zunächst wird unter der UV-Lampe ermittelt, wo sich die einzelnen Substanzen auf der Platte befinden. Unter der UV-Lampe sind diese deutlich sichtbar. Man kreist die Flecken ein und bestimmt den Mittelpunkt in etwa. Um den R f -Wert zu ermitteln, wird die Laufstrecke des Laufmittels ermittelt und die Laufstrecke der einzelnen Substanzen ermittelt(mittelpunkte!). Nun wird der Quotient aus beiden ermittelt. Im Bild (Abb. 3) ist dies jeweils die grünen Strecken geteilt durch die rote Strecke. Laufstrecke Substanz R f = Laufstrecke Laufmittel (gesamt) Es ist offensichtlich, dass der R f -Wert stets zwischen 0 und 1 liegt. Über die R f -Werte der verschiedenen Bestandteile des Gemischs bei dem entsprechenden Laufmittel kann man nun ermitteln, welches Laufmittel das optimale Laufmittel darstellt. Ein optimaler R f -Wert liegt bei 0,3 bis 0,4. 4
5 2 Säulenchromatographie Man füllt eine Säule, indem man Kieselgel(trocken) mit dem Laufmittel dünnflüssig aufschlämmt und in die Säule füllt. Danach füllt man ein: 1. Substanz 2. Seesand 3. Laufmittel bis Säule voll Abbildung 4: Darstellung einer befüllten Säule mit den Bestandteilen Fritte (A), Kieselgel (B), Substanz (C), Sand (D) und Laufmittel (E) Nun lässt man etwa 50mL Laufmittel aus der Säule ab, hier ist noch keine Substanz enthalten. Danach fängt man den Säuleninhalt in Fraktionen in Reagenzgläsern auf und untersucht die Fraktionen mittels Dünnschichtchromatographie, welche Teile des Gemischs enthalten sind. Die Säule darf hierbei niemals trocken laufen, also stets wieder Laufmittel nachfüllen! Die entsprechenden Fraktionen, die nur einen Teil des Gemischs enthalten und somit rein sind, werden gesammelt und das Lösungsmittel eingedampft. So kann man sein Gemisch aufreinigen und Nebenprodukte entfernen. 5
6 Abbildung 5: Auswertung der DCs von einzelnen Fraktionen einer Säulenchromatographie Zuordnung der Fraktionen Zur Zuordnung der Fraktionen muss man sich die Ergebnisse der Dünnschichtchromatographie betrachten. Im Bild ist deutlich zu sehen, dass die erste Substanz erst ab Fraktion 3 auftritt und bis zu Fraktion 7 rein enthalten ist. In den ersten beiden Fraktionen ist nur das Laufmittel enthalten und noch keine gesuchte Substanz. Fraktion 8 enthält Substanz 1 und Substanz 2, sie ist somit nicht besonders geeignet, um eine der beiden Substanzen rein darzustellen, da sie mit der jeweils anderen verunreinigt ist. Substanz 2 ist rein aus den Fraktionen 9 bis 13 zu erhalten. Nach Fraktion 13 ist zunächst keine Substanz mehr enthalten. Hier weiß man nun, dass nur die letzte Substanz, welche äußerst langsam ausgespült wird, enthalten ist. Diese kann durch einen Wechsel des Laufmittels (unpolar nach polar bzw. umgekehrt, sprich reinen Essigester bzw. Hexan) ausgespült werden und ist auch in den Fraktionen 17 und 18 zu beobachten. Die Punkte auf dem DC bleiben weit hinten, da das Laufmittel für die Dünnschichtchromatographie nicht geändert wurde. Würde man dieses Laufmittel ebenfalls ändern, so würden sich die Punkte der Fraktionen 17 und 18 auch weit vorne befinden, allerdings ist dies weder praktikabel noch notwendig. Die einzelnen Fraktionen einer Substanz können nun vereinigt und eingedampt werden, sodass die Substanz als Reinstoff dargestellt werden kann. Das Lösungsmittel wird durch Rotationsverdampfen und Trocknen im Trockenstand vollständig ausgetrieben. 6
7 Reinigung Um die Säule zu reinigen, lässt man das gesamte Laufmittel ab und dreht die Säule dann um, sodass das Gel auslaufen kann. Man stellt am besten einen Erlenmeyerkolben unter, in welchem das Gel trocknen kann. Das trockene Gel wird in der Feststofftonne entsorgt. 7
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