Einfache Tipps und Wege zur Erhöhung der Lebensdauer von HPLC-Säulen. Dr. Frank Michel

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1 Einfache Tipps und Wege zur Erhöhung der Lebensdauer von HPLC-Säulen Dr. Frank Michel 1

2 Übersicht Methode Apparatives Generelles 2

3 Methode Mobile Phase Organischer Modifier Wässriger Anteil Verwendung von Puffern 3

4 Methode Mobile Phase: Anteil an organischem Modifier Je höher der Anteil an organischem Modifier, desto schonender Acetonitril ist (aus Stabilitätsgründen) als aprotisches Lösungsmittel gegenüber MeOH zu bevorzugen Acetonitril (und dessen Gemische mit Wasser) sind niedriger viskos als die von MeOH 4

5 Methode Mobile Phase: Wässriger Anteil Säuren sind unpolarer bei niedrigem ph-wert, bei dem sie protoniert vorliegen; Basen sind unpolarer bei hohem ph- Wert, bei sie nicht protoniert sind. Effect of ph on Hydrophobicity of Acid (A) and Base (B) reversed phase retention (hydrophobicity) AH BH + BH + + OH - <--> B + H 2 O acidic mobile phases B Consider the analyte and the mobile buffer pka! A- A - + H 3 O + <--> AH + H 2 O basic mobile phases ph

6 Methode Mobile Phase: Wässriger Anteil Puffer Für ionisierbare Analyten ist die Kontrolle des ph-wertes Pflicht Puffer kontrollieren (per Definition) nur den ph-wert in der Nähe ihres pka Eines der häufigsten Fragestellungen ist, dass der falsche Puffer für einen gegebenen ph-wert verwendet wird Ionenstärke von 5-10 mm sollte ausreichen (für hochpolare Verbindungen auch mm), falls höhere Ionenstärke benötigt werden, alternative stationäre Phase bedenken Daumenregel: Einstellen des ph-wertes nur +/- 1 ph- Einheit in Bezug auf den pka des Puffers

7 Puffer und Salze für die HPLC Eigenschaften UV-transparent - LC/MS-kompatibel (flüchtig) Partikel-frei Mischbar mit anderen Lösungsmitteln und Proben Rein Nicht-reaktiv Puffer pka (25 C) Max. Pufferbereich UV Cutoff (nm) Bemerkungen Trifluoressigsäure 0, (0.1%) Oxalat 1 1,27 0,3-2,3 --- Phosphat 1 2, Citrat 1 3, Formiat 3, (10mM) * Flüchtiger Puffer Oxalat 2 4,27 3,3-5,3 --- Citrat 2 4, Acetat 1 4, (10mM) * Flüchtiger Puffer Citrat 3 5, Phosphat 2 7, TRIS 8, *Tris(hydroxymethyl)aminomethan Borat 1 9,24 8,2-10,2 --- Ammoniak 9, (10mM) Ammoniumbicarbonat 1 9, Ammoniumbicarbonat 2 10, Triethylamine 10, * Flüchtiger Puffer Pyrrolidin 11, Phosphat 3 12, Borat 2 12, Borat 3 13,

8 Methode Mobile Phase: Wässriger Anteil Auswahl des Puffersalz Angriff auf das Kieselgel anhängig vom Anion des Puffersalzes ph = 10 Puffer (0.1M):MeOH 1:1 C18-Säule 25 C Nach: H.A. Classens, M.A. van Straten, J.J. Kirkland, J. Chrom. A, 728, (1996)

9 Methode Mobile Phase: Wässriger Anteil Stabilitätskritische Punkte Mobile Phase Löslichkeit von Puffersalzen Bei ph-werten größer 8 wird das Basiskieselgel angegriffen Bei ph-werten kleiner 2 erfolgt ein hydrolytischer Angriff auf die Siloxanbindung des Liganden Alternativen: ZrO2, Polymer-Säulen, Ionenpaarreagenzien 9

10 Änderung des ph-wertes nach Mischen mit org. LM 12 ph-wert nach Zugabe von Acetonitril ph-wert vor Zugabe von Acetonitril ph-wert der wässrigen Ammoniumhydroxid-Lösung eingestellt mit Essigsäure vor Zusatz von Acetonitril (x-achse). Bestimmung des ph-wertes nach Zugabe von ACN mit Glaselektrode (gesättigte KCl, kalibriert mit ph 4, ph 7 und ph 10 NIST-standardisierten wässrigen Referenzpuffern). Temp.: 25ºC. 90.0% 75% 50% 32.5% 10

11 Methode Mobile Phase: Puffer Organische Puffer (TRIS, Citrat, Glycin,...) sind schonender als Phosphat Geringere Konzentrationen des Puffersalzes sind schonender Gegenion des Puffers hat eher geringeren Einfluß ph-wert der mobilen Phase NACH dem Mischen mit dem organischen Modifier beachten Filtration nach Herstellung von Pufferlösungen Ggf. Zusatz von Natriumazid Maximale Haltbarkeit von Puffern und wässrigen Phasen: 3 Tage < 15% org. Lösungsmittel: 1 Monat > 15% org. Lösungsmittel: 3 Monate 11

12 Methode HPLC-Säule Säulen mit Typ A-Kieselgel werden schneller abgebaut als Säulen mit Typ B-Kieselgel Langkettig modifizierte Kieselgele sind langlebiger als mit kurzkettigen Liganden modifizierte Endgecappte Säulen sind langlebiger als nicht endgecappte HPLC-Säulen für extreme ph-werte (Discovery Zr, Polymer-Säulen) 12

13 Kieselgel: Typ A Typ B Typ B OH Si Freie/Vicinale Silanolgr. Optimale Oberfläche Niedriger Metallgehalt kaum chelatisierendes Potential HO HO Si Geminal Silanol-Gr. + M Oberflächenmetall Typ A OH OH Si Si Assoziierte Silanol-Gr. OH + M Si Intern gebundenes Metall (Aktivierte Silanol-Gr.) Practical HPLC Method Development 2nd ed., Snyder, Kirkland, Glajch; (1997)

14 Methode HPLC-Säule: Lagerung Immer in organischem Lösungsmittel (MeOH, Acetonitril) Kurzzeitlagerung (3-4 Tage) auch in Gemischen mit Wasser Vor der Lagerung Puffer mit MeOH/Wasser oder ACN/Wasser vollständig entfernen Danach erst Wechsel auf 100% organisches Lösungmittel Verschließen der Säulen (Endfittings, Parafilm) 14

15 Methode HPLC-Säule: Regenerierung Spülen von HPLC-Säulen Säule umdrehen (nicht mit den meisten sub 2 µm-materialien) und nicht mit dem Detektor verbinden Für 250 x 4.6 mm-rp-säulen (andere entspr. umrechnen): Wasserlösliche Proben Warmes (60 C) dest. Wasser 50 ml Methanol 50 ml Acetonitril 25 ml Methanol 25 ml mobile Phase Testen der Säule.. 15

16 Methode HPLC-Säule: Regenerierung Spülen von HPLC-Säulen Säule umdrehen (nicht mit den meisten sub 2 µm-materialien) und nicht mit dem Detektor verbinden Für 250 x 4.6 mm-rp-säulen (andere entspr. umrechnen): Nicht-wasserlösliche Proben 50 ml 2-Propanol 50 ml Methylenchlorid 50 ml Hexan 25 ml Isopropanol 25 ml mobile Phase Testen der Säule 16

17 Methode Temperatur Je niedriger, desto schonender 17

18 Apparatives - Filter Partikel in der mobilen Phase können aus den folgenden Quellen stammen: } Lösungsmittel Additive Niederschläge Probe Abrieb von Pumpe und Injektionsventil 18

19 Apparatives - Hoher ph-wert und stark adsorptive Proben Falls Anwendung von hohem ph-wert unumgänglich: Sättigungssäule Proben mit stark adsorptiven Komponenten: Probenvorbereitung Vorsäulen 19

20 Apparatives - Vorsäulen Totvolumenarm Direct-Connect 20

21 Apparatives - Vorsäulen 21

22 Apparatives - Vorsäulen 22

23 Generell Säulentests, Regelkarten, Logbuch Durchführen von regelmäßigen Säulentests und deren Dokumentation Verwendung von Regelkarten zum einfachen Erkennen von Änderungen Auflösung, Retention und Peakform von Testverbindungen Druck (abh. von mobiler Phase und Temperatur) Führen eines Säulen-Logbuchs (Datum, Säule, mobile Phase, Proben, Anzahl der Injektionen, letztes Laufmittel, Änderungen an der Konfiguration...) 23

24 Säulentestung Engelhardt-Jungheim-Test Säule: 150 x 4.6mm, 5μm Mobile Phase: Methanol:Wasser (55:45) Flußrate: 1mL/min UV: 254nm Engelhardt et al., Chromatographia 29, 59,

25 Säulentestung Engelhardt-Jungheim-Test Säule: 150 x 4.6mm, 5μm Mobile Phase: Methanol:Wasser (55:45) Flußrate: 1mL/min UV: 254nm Engelhardt et al., Chromatographia 29, 59,

26 Säulentestung Tanaka-Tests Tanaka 1: Retentionskapazität, Hydrophobizität, sterische Selektivität (Uracil, Butylbenzol, o-terphenyl, Pentylbenzol, Triphenylen) Tanaka 2: Silanolkapazität (A: Uracil, Coffein, Phenol; B: Pyridin, Phenol) Tanaka 3+4: Iontauschkapazität: Uracil, Benzylamin, Phenol McCalley-Test, Euerby-Test, Neue-Test, Eigene Tests! Prof. Tanaka, Kyoto Institute of Technology, J. of Chrom. Sci. 27, 725,

27 Zusammenfassung Hoher organischer Anteil (Acetonitril statt Methanol) ph-wertbereich beachten (ansonsten Sättigungssäule) Alternative Puffer zu Phosphat verwenden Besser niedrige Pufferkonzentrationen wählen Möglichst niedrige Temperatur wählen Moderne HPLC-Säulen (Typ B-Kieselgel) verwenden Filtration (Proben, mobile Phase) Verwendung von Inline-Filtern (Verschleiß von Pumpen) Verwendung von Vorsäulen Dokumentation (Säulentests, Regelkarten, Logbuch) 27

28 Vielen Dank!

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