Analyse trizyklischer Antidepressiva mit der Agilent Poroshell HPH C18- Säule

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1 Analyse trizyklischer Antidepressiva mit der Agilent HPH C18- Säule Application ote Small Molecule Pharmaceuticals Autor William Long Agilent Technologies, Inc. Einführung Trizyklische Antidepressiva wurden erstmals in den frühen 19er Jahren entdeckt und am Ende dieses Jahrzehnts auf den Markt gebracht. Ihre chemische Struktur enthält ein dreigliedriges Ringsystem. Bei den tetrazyklischen Antidepressiva, die ein Vier-Ringsystem enthalten, handelt es sich um eine eng verwandte Gruppe antidepressiv wirkender Verbindungen. Zyklische Antidepressiva waren mit die ersten Antidepressiva, die entwickelt wurden. Obwohl sie häufig durch neuere Arzneimittel, die weniger ebenwirkungen verursachen, ersetzt werden, stellen sie immer noch eine gute Wahl für viele Menschen dar. Zyklische Antidepressiva wirken dadurch, dass sie mehr eurotransmitter wie Serotonin und oradrenalin im Gehirn verfügbar machen. Dies unterstützt die Gehirnzellen dabei, besser zu kommunizieren, was in Folge die Stimmung beeinflusst. Trizyklische Antidepressiva mit tertiärer Aminstruktur wie Doxepin und Amitriptylin sind wirkungsvollere Serotonin-Wiederaufnahme-Hemmer als trizyklische Antidepressiva mit sekundärer Aminstruktur wie ortryptylin und Desipramin [1,,].

2 Trizyklische Amine sind auch für chromatographische Untersuchungen von Bedeutung. In Abbildung 1 sind diese Verbindungen dargestellt und ihre hohen pka-werte im Bereich von 9, bis 9,6 angegeben. Bei einem ph-wert von 7, liegen die Silanolgruppen des Silica in ihrer ionisierten Form vor und basische Testsubstanzen wie die trizyklischen Antidepressiva sind stark protoniert. Bei einem neutralen ph-wert gehen die trizyklischen Antidepressiva Ionenaustauschwechselwirkungen mit den Silanolgruppen des Silica ein, wenn sie mit diesen in Kontakt kommen. Je mehr Silanolgruppen vorhanden sind, desto stärkeres Peaktailing kann beobachtet werden. Der Tailing-Faktor von Amitriptylin wird als Maß für die Aktivität der Silanolgruppen verwendet []. In dieser Studie wurden die Leistungen von Agilent HPH C18-Säulen und von Säulen anderer Hersteller bei der Analyse von trizyklischen Antidepressiva verglichen. Experimentelles Es wurde ein Agilent 16 Infinity LC-System verwendet, das aus folgenden Komponenten bestand: Agilent 16 Infinity Binäre Pumpe SL, kann bis zu 6 bar liefern (G11B) Agilent 16 Infinity Thermostatierter Säulenofen (G116C) Agilent 16 Infinity Hochleistungsprobengeber SL Plus (G176C) Agilent 16 Infinity Diodenarray-Detektor (G1A) mit 1 mm Schichtdicke und 1-µl-Durchflusszelle (Best.-r. G1-68) In dieser Untersuchung wurden folgende Säulen verwendet: Agilent 1 mm,,7 µm (Best.-r ) Agilent 1 mm, µm (Best.-r ) eue, bei hohen ph-werten stabile, oberflächenporöse Säulen, 1 mm,,6 und µm, eines anderen Herstellers Die Software Agilent ChemStation, Version C.1., wurde zur Steuerung der Geräte und zur Verarbeitung der Daten verwendet. Die untersuchten Verbindungen waren Uracil ( µg/ml), Doxepin-Hydrochlorid ( µg/ml), ortryptylin-hydrochlorid ( µg/ml), Amitriptylin-Hydrochlorid ( µg/ml) und Trimipramin-Maleat ( µg/ml). Sie wurden alle von Sigma Aldrich, Corp. gekauft und in Wasser gelöst verwendet. Abbildung 1 zeigt die Strukturen und Details an. Es wurden jeweils mm Lösungen von atriumdihydrogenphosphat- Dihydrat und Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat, ebenfalls von Sigma-Aldrich, hergestellt und auf einen ph-wert von O Doxepin-HCl pka 9, Amitriptylin-HCl pka 9, HCl HCl Trimipramin-Maleat pka 8, ortryptylin-hcl pka 9,7 HO CH CH Abbildung 1: Struktur trizyklischer Amine. 7, titriert. Acetonitril wurde von Honeywell (Burdick and Jackson) gekauft. Das Wasser wurde mit einem Milli-Q- System (Millipore) filtriert (, µm, 18 MW ). Eine mobile Phase aus bereits vorgemischtem Acetonitril (6 %) und mm atriumphosphat ( %) wurde verwendet, um die Säulen zu testen. Die Säulen wurden bei C temperiert und mit 1 ml/min 1 Minuten vor den Tests äquilibriert. Ergebnisse und Diskussion O Wie in Abbildung 1 angegeben, liegen die pka-werte der trizyklischen Antidepressiva zwischen 8 und 1, d. h. es handelt sich bei diesen Verbindungen eindeutig um Basen. Proben, die ionisierbare Verbindungen wie z. B. Basen enthalten, lassen sich im Allgemeinen am besten mit mobilen Phasen mit einem ph- Wert von oder darunter trennen. Bei diesen ph-werten sind die möglichen Wechselwirkungen mit Silanolgruppen der Säule am geringsten. Bei einem ph-wert mit, und darüber können Restsilanolgruppen auf der Säulenoberfläche als O - vorliegen. Diese negativ geladenen Oberflächensilanolgruppen können Ionenaustauschwechselwirkungen mit positiv geladenen basischen Substanzen eingehen. Dies ist der häufigste Grund für Peaktailing. Viele Trennungen werden optimalerweise jedoch bei mittleren (-8) oder höheren ph-werten (>9) durchgeführt, da die Probenkomponenten bei einem niedrigen ph-wert nicht stabil sind. Basische Substanzen sind bei niedrigen ph-werten protoniert und eluieren zu schnell oder erfordern Bandenabstände, die bei niedrigen ph-werten nicht gegeben sind. O OH H HCl

3 Die meisten Chromatographieanwender sind sich darüber im Klaren, dass herkömmliche Kieselgel-basierte Säulen normalerweise aufgrund der möglichen Auflösung des Silica- Trägermaterials und dem damit einhergehenden Säulenversagen nicht für den Betrieb bei höheren ph-werten (zum Beispiel ph >8) empfohlen werden. Bei Trennungen, die für eine Durchführung im ph-bereich von 6-8 ausgelegt sind, können Probleme auftreten. Die Löslichkeit des Silica-Trägermaterials kann in diesem ph-bereich erheblich sein, sodass die Reproduzierbarkeit der Trennungen und die Lebensdauer der Säule hinter den Erwartungen zurückbleiben. Es wurde bereits beschrieben, dass der Verschleiß von Kieselgel-basierten Säulen bei mittleren (und höheren) ph-werten im Großen und Ganzen seine Ursache in der Auflösung des Silica-Trägermaterials hat und nicht im Verlust der gebundenen organischen Substrate durch Hydrolyse []. Außerdem wurde herausgefunden, dass die Löslichkeit des Silica-Trägermaterials im ph-bereich von 6-8 durch einen vorhandenen Phosphatpuffer deutlich erhöht ist, insbesondere bei höheren Temperaturen und höheren Pufferkonzentrationen [6]. Es wurde gezeigt, dass die Agilent HPH C18-Säule im Betrieb mit Ammoniumbicarbonat- und Phosphatpuffer stabil ist. Sie ist daher mittlerweile eine sehr gern gewählte Säule für Applikationen bei mittleren bis hohen ph-werten. Es wurden Applikationen veröffentlicht, die diese Säulen mit Phosphat-/Boratpuffer, Triethanolamin-/Phosphatpuffer und Phosphat-, Ammoniumhydroxid- und Ammoniumbicarbonatpuffer verwenden. Chromatographieanwender können mit diesen Säulen die Vorteile der hohen Effizienz von oberflächenporösen Säulen und gleichzeitig eine lange Lebensdauer bei erhöhtem ph- Wert oder erhöhter Temperatur nutzen [7,8,9]. Abbildung zeigt Chromatogramme von HPH C18- Säulen, eine Säule mit -µm-partikeln (A) und eine Säule mit,7-µm-partikeln (B), beide im Format 1 mm. Säulen mit diesen Abmessungen werden immer gängiger, da sie weniger Lösemittel verbrauchen als die herkömmliche Größe mit,6 mm Durchmesser. Ein geringerer Lösemittelverbrauch ist gleichbedeutend mit geringeren Betriebskosten beim Einkauf und der Entsorgung der Lösemittel. Säulen der Abmessungen 1 mm werden auch häufig in Verbindung mit der Massenspektrometrie verwendet. Wie in der zusammenfassenden Tabelle und im Chromatogramm gezeigt, weisen alle Peaks eine gute Peakform mit minimalem Tailing auf. Die Peakeffizienz, bestimmt am Trimipramin-Peak, betrug bei der,7-µm-säule 1679 und bei der -µm-säule Beide Säulen können mit einem Gerät bis bar gut betrieben werden. Der Druck liegt für die,7-µm-säule bei 8 bar und für die -µm-säule bei 1 bar. Die Retentionszeit auf der -µm- Säule ist geringfügig kürzer als bei der,7-µm-säule, wobei die Elutionsreihenfolge und die Selektivität für die Verbindungen auf beiden Säulen ähnlich sind, d. h. die Säulen sind skalierbar. 1 1 A 1,67,, 1 1 B 1,69,,,8,88 Agilent 1 mm, µm 1 bar Puffer ( mm atriumphosphat, ph 7) 1 ml/min, C, nm 1,1 1,78 Peakzuordnung 1. Uracil, µg/ml. Doxepin, µg/ml. ortryptylin, µg/ml. Amitriptylin, µg/ml. Trimipramin, µg/ml 1, 1,,,,,, Agilent 1 mm,,7 µm 8 bar Puffer ( mm atriumphosphat, ph 7) 1 ml/min, C, nm 1,1 1,986 1, 1,,,,,, Abbildung : Mischung trizyklischer Antidepressiva in Phosphatpuffer bei ph 7 auf Agilent HPH C18-Säulen. Verbindung Tailing bei Agilent µm Effizienz bei Agilent µm Tailing bei Agilent,7 µm Effizienz bei Agilent,7 µm Doxepin 1, , ortryptylin 1,6 71 1, 97 Amitriptylin 1, 788 1,1 1 8 Trimipramin 1, , 1 679

4 Abbildung zeigt Chromatogramme von zwei bei hohen ph- Werten stabilen, oberflächenporösen Säulen eines anderen Herstellers. Die Chromatogramme zeigen, dass die Peakform der trizyklischen Amine schlechter ist als in den Chromatogrammen der HPH C18-Säulen in Abbildung. Durch die schlechte Peakform für Basen ist die Effizienz der,6-µm-säule eines anderen Herstellers niedriger als die der HPH C18,7-µm-Säule. Der Druck bei der -µm-säule eines anderen Herstellers ist niedriger als bei der HPH -µm-säule, der Unterschied ist jedoch gering. Schlussfolgerungen Es wurde gezeigt, dass Agilent HPH C18-Säulen in Ammoniumbicarbonat- und Phosphatpuffern bei hohen und mittleren ph-werten eine gute Beständigkeit besitzen und daher eine gute Wahl für Chromatographieanwender darstellen. In dieser Application ote wird die hervorragende Peakform von HPH C18 mit Materialien anderer Hersteller verglichen. Da die Peakform die Trennleistung der Säule beeinflusst, darf die Bedeutung guter Peakformen, insbesondere bei der Analyse basischer pharmazeutischer Verbindungen, nicht unterschätzt werden. A 17, ,6, B 1,1,6, Säule Y eines anderen Herstellers, C18, 1 mm, µm 97 bar Puffer ( mm atriumphosphat, ph 7) 1 ml/min, C, nm,679,791 1,7,89 Peakzuordnung 1. Uracil, µg/ml. Doxepin, µg/ml. ortryptylin, µg/ml. Amitriptylin, µg/ml. Trimipramin, µg/ml 1, 1,,,,,, 1, 1,6 Säule Y eines anderen Herstellers, C18, 1 mm,,6 µm bar Puffer ( mm atriumphosphat, ph 7) 1 ml/min, C, nm 1, 1,,,,,, Abbildung : Mischung trizyklischer Antidepressiva in Phosphatpuffer bei ph 7 auf oberflächenporösen Säulen anderer Hersteller. Verbindung Tailing bei,6 µm Effizienz bei,6 µm Tailing bei µm Doxepin, 99,97 ortryptylin, ,96 6 Amitriptylin,1 916,1 68 Trimipramin 1, ,6 968 Effizienz bei µm

5 Literatur 1. Tricyclic antidepressants and tetracyclic antidepressants. conditions/depression/in-depth/antidepressants/art Tricyclic antidepressants. Doxepin. Jing, L. L.; Jiang, R.; Liu, P.; Wang, P.; Shi, T. Y.; Sun, X. Selectivity differences between alkyl and polar modified alkyl phases in reversed phase high performance liquid chromatography. J. Sep. Sci. 9,, 1-.. Kirkland, J. J.; Henderson, J. W.; DeStefano, J. J.; van Straten, M. A.; Claessens, H. A. Stability of silica-based, endcapped columns with ph 7 and 11 mobile phases for reversed-phase high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 1997, 76, Claessens, H.; van Straten, M. A.; Kirkland, J. J. Effect of buffers on silica-based column stability in reversed-phase high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A 1996, 78, Long, W. J.; Mack, A. E.; Xiaoli, Wang; Barber, W. E. Selectivity and Sensitivity Improvements for Ionizable Analytes Using High-pH-Stable Superficially Porous Particles. LCGC 1, (). 8. W. J. Long. Automated Amino Acid Analysis using an Agilent HPH C18 column; Application ote, Agilent Technologies, Inc. Publikationsnummer E, R. Fu, Q. Lei. Fast Analysis of Oxidative Hair Dyes at High ph with HPH C18 and Other Phases; Application ote, Agilent Technologies, Inc. Publikationsnummer 991-6E, 1. Weitere Informationen Diese Daten stellen typische Ergebnisse dar. Weitere Informationen zu unseren Produkten und Leistungen finden Sie auf unserer Website unter

6 Ausschließlich zu Forschungszwecken. icht für Diagnoseverfahren geeignet. Agilent haftet weder für hierin enthaltene Fehler noch für eben- oder Folgeschäden in Zusammenhang mit der Bereitstellung, Leistung oder Verwendung dieses Materials. Änderungen vorbehalten. Agilent Technologies, Inc., 1 Gedruckt in den USA, 7. Dezember DEE