Grundlagen der Chromatographie

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1 Grundlagen der Chromatographie

2 Was ist Chromatographie? Trennung ähnlicher Moleküle aus komplexen Gemischen o Die Analyte werden in einer mobilen Phase gelöst und darin durch eine stationäre Phase transportiert. o Die Phasen werden so gewählt, dass sich die Analyte unterschiedlich in ihnen verteilen. o Durch die dadurch entstehenden Mobilitätsunter- schiede trennen sich die Komponenten in Banden auf.

3 Ionenchromatographie HPLC o Stationäre Phasen sind Ionenaustauscher (meist Kunstharze auf Polystyrenbasis) mit immobilisierten geladenen funktionellen Gruppen: Anionenaustauscher: [ N(CH3)3+ OH-] Kationenaustauscher: [ SO3- H+] o Mobile Phasen sind Elektrolyte Niedrigkonzentrierte Salzlösungen,Säuren oder Basen o Elution erfolgt entweder durch Erhöhung der Ionenstärke oder durch ph-änderung!

4 Stationäre Phase Poröse stationäre Phase (z.b. Polymerteilchen) Mobile Phase kommt in 2 Formen vor: fließend, zwischen den Teilchen stagnierend, in den Poren Analyte werden je nach Größe in die Poren der stationären Phase eindringen können, oder werden vom Poren ausgeschlossen. HPLC

5 Mobile Phase (Eluent) Mobile Phase tritt nicht mit dem Analyten in Wechselwirkung, sondern sorgt nur für den Transport des Analyten durch die Säule! Eigenschaften Chemische und physikalische Eigenschaften bedingen Elutionskraft (z.b. Ionenstärke, Lipophilität, etc) Flußraten oft für Trennungen sehr wichtig Massefluß: ml min-1 Lineare Strömungsgeschwindigkeit (µ)

6 Die Trennung I S D C

7 Trennung des Analyten

8 Das Chromatogramm tr2 tr1 o o tm o o tr... Retentionszeit tm... Totzeit w... Basisbreite k... Kapazitätsfaktor (Retentionsfaktor) Detektorsignal h wh o w tm tr1 tr2 Zeit k = tr - t M t R tm tm =

9 Relative Retention (Trennfaktor) Trennfaktor α ist ein Maß für die Selektivität des Systems k2 α= ο α wird durch die Eigenschaften der mobilen und stationären Phase bestimmt. o k ist von der Säulenlänge und von der Geschwindigkeit der mobilen Phase unabhängig! o Peaks werden nur getrennt wenn k1 und k2 unterschiedlich sind. k1

10 Die Auflösung Die Auflösung R zweier benachbarter Peaks A + B ist definiert als: R = 0.5 R = 0.8 R= 2 (trb - tra) wa + wb R = 1.5

11 Beeinflussung der Trennung R = (α - 1). N. ( ) 1 + k k Leistungsfähigkeit der Trennsäule Selektivität des Systems Wechselwirkungen Stärke des Elutionsmittel

12 Verbesserung der Trennung N und k' bleiben gleich α und k' bleiben gleich N und α bleiben gleich α N 1. Relative Retention (α) Änderung der station. Phase Wechselwirkungen der mob. Ph. 2. Trennstufenzahl (N) bessere oder längere Säule (2L 1.4 R); v von mobil. Phase 3. Kapazitätsfaktor (k ) k' Stärke der mobilen Phase ändern

13 Quantifizierung o Etablierung der Basislinie o Messung der Peak-Flächen oder -Höhen o Kalibration anhand von Standards

14 Basislinie Die Basislinie ist nicht (immer) eben! schlecht getrennte Peaks Tailing oder Fronting Drift der Basislinie spät eluierende Peaks Säulenbluten

15 Peak-Fläche und Peak-Höhe o Abschätzung der Peak-Fläche A über die Breite auf halber Höhe (wh = b0.5) A = wh. h o Mit Integratoren oder Computerprogrammen errechenbar. Erkennung des Peak-Anfangs und Endes wichtig.

16 Kalibration Für jede Substanz wird eine Kalibrationskurve erstellt. Kalibration sollte mindestens 4 Konzentrationen beinhalten und mit jeder neuen Charge an Proben neu erstellt werden!

17 Detektion HPLC o Detektion in der Ionenchromatographie erfolgt meist mit Leitfähigkeits-Detektoren o Da der Eluent in der IC immer ein Salz oder eine Säure/Base ist, Besitzt der Eluent immer eine hohe Eigenleitfähigkeit o Daher ist eine Supression der Eigenleitfähigkeit notwendig (elektronisch oder chemisch)

18 HPLC Supression der Eigenleitfähigkeit

19 HPLC Systeme.. bestehen aus Modulen! Pumpe Trennsäule Detektor Eluent Einspritzventil

20 Injektoren Rheodyne HPLC

21 Anwendungen der IC HPLC o Auftrennung organischer und anorganischer Ionen (insbesondere von Anionen, für die nur wenige verläßliche Trennmethoden existieren) o Bestimmung von Kohlenhydraten an Anionentauschern (KH sind im alkalischen Millieu geladen!) o Bestimmung von Aminosäuren an Kationentauschern (Aminosäuren sind amphotere Substanzen und im liegen unterhalb von ph=6 vollständig als Kationen vor) o Wichtige Methode bei der Trennung von Proteinen (AEC an schwachen Anionenaustauschern)

22 HPLC Chromatographie

23 HPLC System ICS 3000

24 HPLC Systeme.. bestehen aus Modulen! Pumpe Trennsäule Detektor Eluent Einspritzventil

25 Säule Poröse stationäre Phase (z.b. Polymerteilchen) Mobile Phase kommt in 2 Formen vor: fließend, zwischen den Teilchen stagnierend, in den Poren Analyte werden je nach Größe in die Poren der stationären Phase eindringen können, oder werden vom Poren ausgeschlossen. HPLC

26 Trennung

27 Supressor HPLC

28 Kalibration Für jede Substanz wird eine Kalibrationskurve erstellt. Kalibration sollte mindestens 4 Konzentrationen beinhalten und mit jeder neuen Charge an Proben neu erstellt werden!

29 Chromatogramm

30 Standard 6.25 ppm

31 Chromatogramm Blatt

32 Chromatogramm Spross

33 Chromatogramm Wurzel

34 Auswertung

35 HPLC System ICS 3000

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