HPLC im Spannungsfeld zwischen Auflösung und Probedurchsatz

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1 HPLC im Spannungsfeld zwischen Auflösung und Probedurchsatz Thomas Welsch, v. Universität Ulm, Institut für Analytische und Bioanalytische Chemie, Ulm, Deutschland TZ ekolampad, Basel, Schweiz 6. ktober 202 Trennanalytik im Wandel Schneller - Selektiver - Sensitiver Zielsetzungen bei der chromatographischen (chromatographisch-spektroskopischen) Analytik Trennung und Detektion aller in einem Gemisch enthaltenen Komponenten in einem definierten Konzentrationsbereich Trennung und Detektion aller nachzuweisenden / aller zu bestimmenden Komponenten Geringe Analysenzeit / hoher Probendurchsatz Bestimmung von geringen Konzentrationen bei begrenzter Probenmenge Hohe Robustheit der Methode / des Analysenverfahrens Moderate Betriebsparameter Geringe Kosten

2 Chromatochraphisches Wünsche-Viereck und zu bezahlender Preis AUFLÖSUNG (Zeit) GESCHWINDIGKEIT Druck, Spannung? NACHWEISVERMÖGEN Scale down PRBEKAPAZITÄT Scale up, Geld Auflösung R benachbarter Peaks w t R3 t R4 R = 0,9 w 2 w 3 w 4 w 5 R =,5 für eine Basislinientrennung benachbarter Peaks: t R Auflösung R für das benachbarte Peakpaar 3 / 4: R 3 / 4 = t 2 R4 ( σ + σ ) 3 t R3 4 oder R 3 / 4 = 2 t w R4 3 t + w R3 4 oder R 3 / 4 =,76 t w R4 h3 t + w R3 h4 2

3 Einfluss von Retention (k), Selektivität (α) und Effizienz (N) R L d N Hp α α k k + Einfluss des Retentionsfaktors k auf die Auflösung t R = 0,80,2,80/,88,78 2,753,0/3,36 min 5,4 min k = 0 0,5,25/,35,23 2,442,88/3,20 dimensionslos 5,76 k = 0,34 0,56/0,57 0,55 0,74/0,76 0,85 k + t M Zeit [min] 3

4 Verbesserung der Auflösung durch Erhöhung der Selektivität oder Verringerung der Dispersion (Peakbreite) R Effizienz N = 4 L d α α k k p + Selektivität α Detektor-Selektivität Einfluss der Selektivität auf die Auflösung ZIEL: R =,5 Erhöhung von α auf 05 % N = α =,02 k = 0 R = =,5 N = α =,07 k = 0 45 times R = =,5 α Erhöhung von auf 325 %! α 4

5 Chromatographie mit flüssiger mobiler Phase Trennung durch unterschiedliche Wechselwirkungen Analyt-Molekül R X WW Zentren Lösungsmittel-Molekül Y R STATINÄRE PHASE Trennung durch Selektivitätsveränderung Selektivität wird durch das Phasensystem hervorgerufen: Stationäre Phase: Basispackungsmaterial, Art und berflächenkonzentration der zu Wechselwirkung mit den Analyten fähigen Gruppen Mobile Phase: Art und Volumenanteil der einzelnen Lösungsmittel in der mobilen Phase; ph für ionogene Analyten in wässrigen Eluenten Quelle: Drouen et al. in P.J.Schoenmakers (Ed.), ptimization of Chromatographic Selectivity, J. Chrom. Library, 35 (986) 5

6 Verbesserung der Auflösung durch Verringerung der Dispersion (Verbesserung der Effizienz/Erhöhung der Bodenzahl) R Effizienz N = 4 Detektor-Selektivität L d α α k k p + Peakkapazität Die Peakkapazität n c gibt die Zahl der Peaks an, die mit einer bestimmten Auflösung in einem bestimmten Retentionszeitfenster getrennt werden können n c = 0 R* =, N n = + ln + 4 ( ) c k max (GIDDINGS) t ZMP = w R0 0 t w R (STRUPPE) w ln w 0 V. Meyer, T. Welsch, LC-GC International 996, 0,

7 Abhängigkeit der Peakverbreiterung (theoretische Bodenhöhe) von Diffusionsvorgängen und der Fließgeschwindigkeit (Van Deemter Beziehung) s s s s EDDY-DIFFUSIN LNGITUDINAL-DIFFUSIN LATERAL-DIFFUSIN PREN-DIFFUSIN MASSENAUSTAUSCH Säule: L = 50 mm, i.d.: 4 mm; Partikeldurchmesser d p = 5 µm; Porosität ε = 0,8; Packungsqualität: λ = ; γ = 0,5; Fluss =,0 ml/min; Diffusionskoeffizient D m = x 0-9 m 2 /s; Retentionsfaktor k = 0 B H = 0 Aµm + µm + C 4 µm. u u H = 2λ dp 2 γ Dm + u + f(k) D 2 p d m u Formeln zur Abschätzung der Effizienz und der erforderlichen Säulenlänge N 3000 (cm) L (cm) L d p (µm) (µm) 3 d p (für ca th. Böden) 7

8 Van Deemter Plot Trennstufenhöhe H [µm] H = 2λ dp + 2γ Dm u + 2 dp u f(k) Dm C. u A 0 0 B/u Fließgeschwindigkeit u [mm/s] Boden- oder Trennstufenzahl vs. Fließgeschwindigkeit Bodenzahl N Fließgeschwindigkeit u [mm/s] 8

9 Entwicklung der Partikelgröße und Geometrie Partikel - Durchmesser Partikel - Form Bodenzahl bei 0 cm Säulenlänge Jahr 00 µm irregulär 35 µm pellicular 0 µm irregulär sphärisch 5 µm sphärisch 3 µm sphärisch porös porös porös porös GLAS s ,5 µm sphärisch unporös µm poroshell ,7 2,2 µm sphärisch porös U H P L C µm poroshell Schnelle Trennung von Benzodiazepinen an unporösen,5 µm Partikeln Säule: 30 x 4,6 mm, ChromSphere UP C8,,5 µm, Spez.F: 2 m 2 /g Mobile Phase: ACN/H 2 : 5/85 (v/v) Fluss: 3,5 ml/min, Druck: 550 bar Injektionsvolumen: µl Detektion: UV, 254 nm, Zellvolumen: µl N = 6000, H = 5 µm, h = 3.3 φ = 650, E = seconds T. Welsch, N. Lammers, G. Mayr Reduction of Analysis Time in LC in E. Kaiser, H. Gunz, W. Günther (Eds.) Chromatography, InCom, Duesseldorf 997, p Veronika R. Meyer, Praxis der Hochleistungs-Flüssigchromatographie, Salle Sauerländer, Aarau Frankfurt Salzburg 999, S. 4 9

10 Ultra High Performance Liquid Chromatography behauptete Merkmale Ultra schnell / maximaler Probedurchsatz / geringe Cycluszeiten = 30 Sekunden Hohe Effizienz / Hohe Auflösung = plates Sehr schnell, dabei höhere Auflösung Höhere Empfindlichkeit Geringer Eluentenverbrauch Hohe Produktivität Kleine Bodenhöhe und hohe Eluentengeschwindigkeit durch kleine Partikel H [µm] Fluss: ,70,20 2,00 4,00 ml/min 4,6 mm i.d. 0,5 0,25 0,40 0,85 ml/min 2, mm i.d. d p = 0 µm d p = 5 µm u Praxis = 3 x u optimum u [mm/s] d p = 3 µm d p =,5 µm Säule 3 B H = A? + + C? d p, A =, B = 2, C = 0.44 (k = 5), D? m =. 0-9 m 2 /s, η = mpa. s G. Mayr, T. Welsch, J. Chromatogr. A 845 (999) 55 0

11 Konsequenzen bei der Verwendung kleiner Partikel Mit Verkleinerung der Partikel verbessert sich die Bodenhöhe, die Auflösung bei gleicher Säulenlänge und die Analysengeschwindigkeit aber Ø: 5 µm Ø:,7 µm N L t R p p H d p 2 H F d p L L Zusammenhang zwischen Partikeldurchmesser d p, Druckabfall p und Analysenzeit t R Druckabfall p [bar] L = 5 cm F = 4,0 ml/min p = 935 bar t R =,8 min d p : 2,2 µm L = 7 cm F = 3,0 ml/min p = 585 bar t R = 3,5 min L = 9 cm F =,9 ml/min p = 256 bar t R = 6,9 min L = 5 cm F =,2 ml/min p = 97 bar L = 30 cm t R = 8 min F = 0,7 ml/min p = 28 bar t R = 76 min Partikeldurchmesser d p [µm] Retentionszeit t R [min] L = 60 cm, F = 0,25 ml/min p = 5 bar t R = 360 min Parameter: N = 0 000, k = 0, d c = 4,6 mm, F = F für 3 x u opt, D m = 0-9 m 2 /s, η = mpa s, ε = 0,8

12 Auswirkungen der Partikel-Verkleinerung Ø: 5 µm Ø:,7 µm Säulenlänge für N = 0 000: 5 cm 5 cm Fließgeschwinigkeit u = 3 x u opt :,5 mm/s 5,0 mm/s Flussrate für 4,6 mm i.d. Säule:,2 ml/min 4,0 ml/min Flussrate für 2, mm i.d. Säule: 0,25 ml/min 0,85 ml/min Eingangsdruck (ε = 0,8, η = ): 97 bar 935 bar Retentionszeit für Peak mit k = 5: 26 min 2,7 min Eluentenverbrauch pro Lauf: 6,4 ml (2, mm i.d. Säule) 2,3 ml (2, mm i.d. Säule) Verwendung von Poroshell Partikeln alternativ zu voll porösen Partikeln im,5 2,4 µm Bereich Poroshell Partikel Voll poröse Partikel Ø: 2,7 µm Ø:,7 µm,7 µm 0,5 µm Säulenlänge für N = 0 000: 7,5 cm 5 cm Fließgeschwinigkeit u = 3 x u opt : 3,8 mm/s 5,0 mm/s Flussrate für 2, mm i.d. Säule: 0,43 ml/min 0,85 ml/min Eingangsdruck (ε = 0,5/0,8, η = )η : 363 bar 935 bar Retentionszeit für Peak mit k = 5: 5,2 min 2,7 min Eluentenverbrauch pro Lauf: 2,2 ml 2,3 ml Merkmale: + Sehr gute Stoffaustauschkinetik, auch + Hoher Probedurchsatz, größere für größere Moleküle, moderater Druck Probekapazität - geringere Probekapazität - Höchster Druck 2

13 Gradient-Separation of hormones on.5 µm particles Substance: Prednison 2 Hydrocortison 3 9-Nortestosteron 4 -Dehydro-7α methyltestosteron 5 Testosteron 6 7α-Methyltestosteron 7 Ethisteron 8 Progesteron Column: SS, 30 x 4.6 mm ChromSphere UP C8,.5 µm; Gradient: 0-3 min H 2 : MeH, 75 : 25 (v/v) to00 % MeH; Flow rate: 2.7 ml/min; Initial Pressure: 530 bar; Temp.: 40 C; Detection: UV, 254 nm, cell volume µl, data sampling rate 60 Hz T. Welsch, N. Lammers, G. Mayr Reduction of Analysis Time in LC in E. Kaiser, H. Gunz, W. Günther (Eds.) Chromatography, InCom, Duesseldorf 997, p Performance-Test von 4 Säulen (dp: 0 µm, dp: 5 µm, dp: 3 µm; dp: 2 µm) mittels isokratischer Trennung eines Gemisches von 8 Komponenten Säulen: Silica-C8, 2 nm: 25 cm x 4,6 mm, dp: 0 µm; 5 cm x 4,6 mm, dp: 5 µm; 0 cm x 3 mm, dp: 3 µm; 5 cm x 2 mm, dp: 2 µm Mobile Phase: H 2 : ACN, 52 : 48 (v/v), Viskosität bei 35 C ca. 0,68 mpa s Temperatur 35 C (Umluftsäulenthermostat), Eluent vorgewärmt durch statischen Mischer und Edelstahlkapillare, m x 0,5 mm i.d. (200 µl) vor Dosierventil Detektion für 0 µm, 5 µm und 3 µm Säule: UV, 254 nm, Zellvolumen: 6 µl, Detektion für 2 µm Säule: UV, 254 nm, Zellvolumen 3 µl Injektionsvolumen für 0 µm, 5 µm und 3 µm Säule: 5 µl, Verbindungskapillaren Injektor-Säule: Edelstahl, 5 cm x 0,25 mm i.d., Säule Detektor: PEEK, 28 cm x 0,7 mm i.d. Injektionsvolumen für 2 µm Säule: µl, Verbindungskapillaren Injektor-Säule: Edelstahl, 0 cm x 0,25 mm i.d., Säule-Detektor: PEEK, 7 cm x 0,25 mm i.d. 3

14 Testgemisch für die RP Chromatographie H 2 2-Phenylethanol N 2 N 2 7 2,4-Dinitrotoluol NH 2 H N 2 NH 2 3 N 2 N ,4-Dinitroanilin 2-Methyl-5-nitroanilin 2,4-Dimethylphenol CH H 3 CH 3 CH 3 H H H 8 9 N 2 0 Benzol 7α-Methyltestosteron 4-Nitrotoluol Ethylbenzoat 6 Methylbenzoat 2 Butyrophenon N 2 CH 3 CH 3 N 2 CH 3 H H H 8 Toluol 2-Nitronaphthalin Propylbenzoat Valerophenon 2-Methyl- -nitronaphthalin Progesteron Chromatogramme des RP-Testgemisches auf mit 0 µm, 5 µm, 3 µm und 2 µm Partikeln gepackten Säulen Säule: 250 x 4,6 mm; Dp: 20 bar u:,5 mm/s; F: 0,7 ml/min Säule: 00 x 3 mm; Dp: 40 bar u: 2,76 mm/s; F: 0,8 ml/min t R [min] t R [min] Säule: 50 x 4,6 mm; Dp: 85 bar u: 2,47 mm/s; F:,5 ml/min Säule: 50 x 2, mm; Dp: 320 bar u: 6,08 mm/s; F: 0,8 ml/min ,5,0,5 2,0 t R [min] t R [min] 4

15 Bodenzahl N vs. Fließgeschwindigkeit u für 4 Säulen t R (6) = 38, min, t Rrel = 25,5; H = 22,5 µm, h = 2,25; F = 0,7 ml/min, V R (6) = 26,7 ml; p = 5 bar N µm 5 µm 3 µm µm t R (6) =,2 min, t Rrel = 7,5; H = 9,5 µm, h =,9; F =,5 ml/min, V R (6) = 6,8 ml; p = 5 bar t R (6) = 6, min, t Rrel = 4; H = 8,7 µm, h = 2,9; F = 0,8 ml/min, V R (6) = 4,9 ml; p = 40 bar t R (6) =,5 min, t Rrel = ; H = 8,8 µm, 2000 h = 4,4; F = 0,8 ml/min, V R (6) =,2 ml; p = 320 bar u [mm/s] Analyt: Valerophenon, k ~ 9,7 Bei der Ultra High Performance Liquid Chromatography besonders zu beachten: Strenge Gerätehygiene Minimierung von Totvolumina Physikalische Effekte bei der Gradientenformung (Niederdruck-, Hochdruck-); Unterschiedliche Dwell-Volumina verschiedener Geräte / Gerätekonfigurationen Reibungswärmeeffekte in der Säule Abhängigkeit der Retention / Peakform von der Art der Säulenthermostatisierung Abhängigkeit der Retention vom Druck Anpassung der Injektions- und Detektionsvolumina Höhere Datenrate (= 60 Hz) 5

16 Erzielung sehr hoher Trennstufenzahlen (hohe Auflösung / Peakkapazität) zur Trennung komplexer Gemische durch serielle Säulenkopplung dp [µm] h H [µm] L [cm] N F [ml/min] Dp [bar] t R [min] ) 5 2, ,2 3 2,5 3, ,4 66 4,7 3,4 6 7, , Serielle Kopplung von 8 Säulen: 5 2, , ,5 3, , ,7 3, , Einzelsäulen: dp = 5 µm, L = 50 mm x 2, mm; Porosität ε = 0.7; Packungsqualität λ = 0,8; γ = 0.5; dp = 2,5 µm, L = 00 mm x 2, mm; Porosität ε = 0.7; Packungsqualität λ =,0; γ = 0.5; dp =,7 µm, L = 75 mm x 2, mm; Porosität ε = 0.7; Packungsqualität λ =,2; γ = 0.5; Retentionsfaktor k: 5; Säulentemperatur: 60 C; Eluentenviskosität: 0,4 mpa s; High peak capacity D-HPLC Courtesy of Prof. P. Sandra, RIC, Kortrijk, Belgium Human serum tryptic digest (depleted for the 6 most abundant proteins) Peak capacity: Time (min) 8 x 25 cm (2 m) x 2. mm i.d. Columns Zorbax SB300-C8, 5 µm; Mobile Phase: H 2 /ACN, Gradient; Flow rate: 0.2 ml/min, u =.5 mm/s; Pressure: bar; Temperatur: 60 C; Detection: UV, 20 nm K. Sandra et al. Journal of Separation Science, 30 (2007) 24 6

17 Ultra High Performance Liquid Chromatography Ultra schnell / maximaler Probedurchsatz / geringe Cycluszeiten = 30 Sekunden Hohe Effizienz / Hohe Auflösung = plates Sehr schnell, dabei höhere Auflösung Höhere Empfindlichkeit nur bei begrenztem Probevolumen Geringer Eluentenverbrauch Hohe Produktivität Hohe Robustheit der Methode / des Analysenverfahrens Moderate Betriebsparameter Geringe Kosten Fazit: Es ist nach wie vor zu entscheiden, ob bei der Entwicklung einer HPLC-Methode der Schwerpunkt bei hoher Auflösung (hohe Peakkapazität) oder bei kurzer Analysenzeit / hohem Probedurchsatz liegt oder Auflösung durch Kopplung der LC mit der Massenspektrometrie substituiert wird. Hohe Auflösung (hohe Peakkapazität) lässt sich bei akzeptablen Betriebsbedingungen mit langen Säulen und größeren Partikeln (= 5 µm) unter Einsatz von Zeit erzielen. Kurze Analysenzeit (hoher Probedurchsatz) lässt sich mit kurzen Säulen und kleinen Partikeln unter Einsatz von Druck erzielen. Die neueste Gerätegeneration der bekannten Hersteller ist für die verschiedenen HPLC-Methoden in gleicher Weise geeignet. Bei der schnellen HPLC spielt eine hohe Gerätehygiene und die richtige Thermostatisierung des Eluenten/ der Säule eine wichtige Rolle. Die Robustheit einer HPLC Methode scheint mit größeren Partikeln größer zu sein als mit kleinen Partikeln. 7

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