2. Theoretische Grundlagen

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1 2. Theoretische Grundlagen 2.1 Typen von Trennmethoden Trennung verschiedener Komponenten in der chemischen Analytik beruht auf Unterschieden in der Verteilung zwischen zwei Phasen und/oder in der Beweglichkeit innerhalb einer Phase der zu trennenden Substanzen. Es werden bevorzugt eindimensionale Trennverfahren eingesetzt, bei denen eine Bewegung aller Komponenten in der gleichen Richtung erfolgt. Die folgenden Bewegungstypen sind relevant. Adsorption/Desorption S m 1 2 Beweglichkeit in Einzelphase Verteilung Gleichgewicht & Beweglichkeit Eindringgeschwindigkeit Elektrophorese (Kap. 5) Gaschromatographie Membrantrenn- Isoelektrische Fokussierung GC (Kap. 3) verfahren Isotachophorese Flüssigchromatographie Dialyse Kapillarzonenelektrophorese HPLC (Kap. 4) Elektrodialyse Kombinierte Formen: Gelpermeationschromatographie Elektrokinetische Micellarchromatographie SDS-PAGE (Trägerelektrophorese) Zweidimensionale Trennmethoden sind meist zwei zeitlich hintereinander geschaltete eindimensionale Trennungen. In der Polypeptidanalytik kommen z.b. häufig 2D Elektrophoresemethoden zur Anwendung (Trennung nach Molmasse und isoelektrischem Punkt). Trennkriterien: a) Kinetische Eigenschaften b) Gleichgewichtseigenschaften (Phasen- und Verteilungs-) Oft liegt eine Kombination von a) und b) vor: a) Trennmethoden unter Ausnutzung von kinetischen Eigenschaften: Massenspektrometrie Elektrophorese Ultrazentrifuge Enzymatischer Abbau Trennverfahren mit porösen Membranen (Dialyse, Elektrodialyse, Gasdiffusion) b) Trennmethoden unter Ausnutzung von Gleichgewichtseigenschaften Phasengleichgewichte: Phasen gebildet durch zu trennende Komponenten (z.b. Destillation) Verteilungsgleichgewichte: Phasen enthalten zum grossen Teil Spezies, die nicht zum zu trennenden Gemisch gehören (z.b. GC, HPLC). 7

2 Übersicht über verschiedene Trennmethoden 2.2 Chromatographie Chromatographie ist ein physikalisch-chemisches Trennverfahren, bei dem die zu trennenden Substanzen zwischen zwei Phasen verteilt werden, von denen die eine, die stationäre Phase, festliegt, während die andere, die mobile Phase, sich in einer bestimmten Richtung bewegt. Ein sinnvolles Schema ergibt sich, wenn man die Gesamtheit der chromatographischen Techniken zunächst nach der eingesetzten mobilen Phase klassifiziert. Geht man von diesem Ansatz aus, so lässt sich die Chromatographie in die drei Hauptgebiete Gaschromatographie (GC), überkritische Fluidchromatographie (SFC) und Flüssigchromatographie (LC) einteilen (siehe Schema). Klassierung der verschiedenen chromatographischen Verfahren (MP: mobile Phase; SP: stationäre Phase) MP Gas Überkritisches Fluid Flüssigkeit SP flüssig fest flüssig fest flüssig fest Adsorbens Molekularsieb Adsorbens Gebundene Phase Adsorbens Gebundene Phase Harz Gel Form Säule Säule Säule Säule planar Säule planar Säule Säule Säule GLC GSC SFC LLC TLC LSC BPC IEC SEC GC LC/TLC/HPLC 8

3 Geschichtsübersicht über wichtige chromatographische Methoden Mobile Phase flüssig fluid gasförmig Stationäre Phase fest Flüssig- Adsorptions- Chromatographie Superkritisches- Fluid-Adsorptions- Chromatographie Gas-Adsorptions- Chromatographie Tswett, 1906, Kuhn, Winterstein, Lederer, 1931 Klesper, 1962 Rijnders, 1966 ovotny, 1981 Ramsay, 1905 Cremer, 1951 Janak, 1953 flüssig Flüssigkeits- Flüssigkeits- Chromatographie Superkritisches- Fluid-Adsorptions- Chromatographie Gas-Adsorptions- Chromatographie Martin, Synge, 1941 Klesper, 1962 James, Martin, Anschauliches Konzept für die Chromatographie: Gedanklich kann man sich eine chromatographische Trennung als eine Reihe von diskreten Extraktionen vorstellen, bei denen sich die Analyten entsprechend ihrem Verteilungsgleichgewicht (Stoffkonstante) zwischen zwei Phasen verteilen. Vorraussetzung ist, dass sich die zwei Phasen nicht ineinander mischen. Phase 1 (z.b. Wasser) Phase 2 (z.b. organisches Lösungsmittel) Sind zwei Analyten A und B (mit unterschiedlichem Verteilungsgleichgewicht) in unserem System, haben wir eine Trennung der beiden Analyten erreicht. 9

4 Eine vollständige Trennung von A und B kann mit einer einmaligen Extraktion nicht erreicht werden. Um eine bessere Trennung zu erreichen, können mehrere Extraktionen hintereinander durchgeführt werden. => Beliebige Wiederholungen Dieses Konzept kann man sich nun kontinuierlich vorstellen: Die Phasen müssen gegeneinander fliessen, sonst wird das System zu einer einzigen grossen Extraktionsstufe. Sie dürfen aber nicht zu schnell fliessen, damit lokal jeweils Gleichgewichte etabliert werden können. Diese Methode heisst Gegenfluss-Extraktion (Counter Current Extraction). Da experimentell sehr aufwändig, wird die Gegenfluss-Extraktion jedoch nur selten angewendet. Viel praktikabler ist es, wenn Phase 2 fest statt flüssig ist. In einer solchen Anordnung fliesst eine Flüssigkeit (Phase 1) über die feste Phase 2, was technisch sehr leicht zu realisieren ist. Definition der Chromatographie: Physikalische Trennmethode, bei der die zu trennenden Komponenten zwischen einer feststehenden (stationären) und einer beweglichen (mobilen) Phase verteilt werden. Im Idealfall verteilen sich alle zu trennenden Substanzen unterschiedlich zwischen den zwei Phasen. Hauptanwendungen für chromatographische Methoden: Analytische Anwendungen Präparative Anwendungen 10

5 Grundarten der Chromatographie: Säulenchromatographie Planare Chromatographie Prinzip der Chromatographie Alle chromatographischen Verfahren basieren auf einer wiederholten Einstellung des Gleichgewichts in mobiler und stationärer Phase und Transport durch mobile Phase. Probe Transport durch mobile Phase mobile Phase (gas oder flüssig) Stoffaustausch HETP (Height Equivalent to a Theoretical Plate) t R stationäre Phase (flüssig oder fest) Trennung eines Gemisches von A und B in einer Säulenchromatographie und das zeitabhängige Detektorsignal: Stoffgemisch Mobile Phase Mobile Phase Stationäre Phase A + B B A B A K A = [ A] S A [ ] M K M = 0 K A < K B M A B t M t A t B 2.4 Einflussfaktoren in einem chromatographischen System 1. Der Verteilungskoeffizient K beschreibt das Verhältnis der Konzentrationen der Substanz A in der mobilen und der stationären Phase im thermodynamischen Gleichgewicht (ernst Verteilung). Mobile Phase Stationäre Phase [A] m [A] s K = A A [ ] stationär [ ] mobil einstufig ernst-verteilung 11

6 Darstellung des Multiextraktionsprozesses (Craig Verteilung): K = K = % 21.9% 10.9% 3.1% 0.4% K = 9 80% K = % Falls verschiedene Substanzen in einem gegebenen chromatographischen System verschiedene K-Werte aufweisen, kann eine Trennung erreicht werden. 2. Die Retentionszeit t R beschreibt die Zeit, die eine Substanz braucht, um ein chromatographisches System zu durchlaufen. t M Totzeit t R Retentionszeit t R reduzierte retentionszeit Der erste Peak mit der Retentionszeit t M stellt eine Substanz dar, die von der stationären Phase nicht zurückgehalten wird. t M wird als Totzeit bezeichnet. 3. Der Kapazitätsfaktor k (oder Retentionsfaktor) beschreibt die Wanderungsgeschwindigkeit einer Substanz in der Säule. k = K V s V M = K β (2.1a) β = V M V s (2.1b) wobei K der Verteilungskoeffizient von A, V s das Volumen der stationären Phase, V M das Volumen der mobilen Phase und β das Phasenverhältnis (LC, 2.1b) bedeuten. k = t R t M t M = t ' R (2.2) t M 4. Der Trennfaktor (oder Selektivitätsfaktor) α beschreibt die Wanderungsgeschwindigkeit zweier Substanzen A und B relativ zueinander. α ist definiert als 12

7 α = K B K A (2.3a) wobei nach Definition A immer jene Substanz ist, die schwächer zurückgehalten wird, sodass α immer grösser als 1 ist. Ersetzen von K A und K B in Gleichung (2.3a) durch k oder t R erhält man eine Gleichung, die den Selektivitätsfaktor als Funktion der Retentionszeiten ausdrückt, ( ' ) B ' t R α = K B = k B = t R K A k A ( ) A (2.3b) wobei t R,B die Retentionszeit der Substenz B ist und t R,A die Retentionszeit der Substanz A. Später in diesem Kapitel sehen wir, dass man α und k benutzen kann, um die Trennleistung einer chromatographischen Säule zu optimieren. 2.5 Effizienz einer chromatographischen Säule Klassische Theorie Wir können das zu Beginn verwendete Bild der hintereinander geschalteten Extraktionen wieder verwenden, bei denen sich für jede Substanz jeweils das Verteilungsgleichgewicht zwischen den Phasen einstellt. Entsprechend diesem Konzept ist es erstrebenswert, wenn möglichst viele Extraktionen hintereinander durchgeführt werden, um eine möglichst vollständige Trennung zu erhalten. Diese theoretischen Extraktionen werden theoretische Böden genannt, wobei die Effizienz einer Säule mit der Anzahl der theoretischen Böden zunimmt. Um experimentell aus einem Chromatogramm zu bestimmen, müssen wir uns zuerst die Form eines typischen (idealen) Elutionspeaks in einem Chromatogramm ansehen. 1.0 Idealer gaussförmiger Peak y = y 0 " e # x 2 2$ 2 normierte Signalhöhe h ! 2! w h = 2.354! w b = 4! 4! x t R ist die Retentionszeit, w b die Basispeakbreite, und σ die Standardabweichung. Für einen idealen gaussförmigen Peak gilt w = 2w 12 = 4σ (2.4) σ 2 = w 2 σ 2 nennt man Varianz und stellt ein Mass für die Breite des Peaks dar. 16 (2.5) 13

8 Anzahl theoretischen Böden und Bodenhöhe H Die Effizienz einer chromatographischen Säule, ausgedrückt als Anzahl theoretischen Böden, kann man definieren als = t 2 R σ 2 (2.6a) Da es oft nicht sehr praktisch ist, σ aus einem Chromatogramm abzulesen, kann man Gleichung (2.5) in (2.6a) einsetzten und erhält =16 t R w 2 (2.6b) Die Anzahl der theoretischen Böden nimmt mit zunehmender Säulenlänge zu. Um unterschiedlich lange Säulen dennoch miteinander vergleichen zu können, wurde ein weiterer Parameter definiert, die Bodenhöhe H H = L (2.7) wobei L die Länge der Säule ist, die oft in mm angegeben wird. 2.6 Einfluss von kinetischen Säulenvariablen auf die Bodenhöhe H In einem chromatographischen System fliesst die mobilen Phase fortlaufend über die stationären Phase, wodurch die Analyten von der mobilen Phase stets weiter getragen werden, bevor sich ein tatsächliches thermodynamisches Verteilungsgleichgewicht einstellen kann. Die Flussgeschwindigkeit der mobilen Phase hat daher einen entscheidenden Einfluss auf die Trenneffizienz einer Säule. Kinetische Theorie van-deemter-gleichung Mit der folgenden Gleichung kann die Änderung der Effizienz (ausgedrückt als H) in Abhängigkeit der Fliessgeschwindigkeit beschrieben werden (Van-Deemter-Gleichung, hier die modifizierte Form nach Hawkes). Die Fliessgeschwindigkeit der mobilen Phase wird mit u bezeichnet. H = A + B u + C u (2.8) wobei A die Eddy-Diffusion, B die longitudinale Diffusion, u die Fliessgeschwindigkeit der mobilen Phase, und C die Masstransfer zwischen den zwei Phasen bedeuten. Der Term A, die Eddy-Diffusion, tritt nur bei gepackten Säulen auf. Wegen der Umwanderung des Analytmoleküls durch die Partikel des Packungsmaterials legen die Analyten unterschiedliche Weglänge zurück. Dieser Vorgang führt zu einer Bandenverbreitung, deren Ausmass von der Partikelgrösse sowie der Homogenität und Dichte der Säulenpackung abhängig. Ausmass Homogenität Dichte

9 B u = 2k D D M u beschreibt die longitudinale Diffusion des Analyten vom Bandenzentrum weg, wobei k D der konstante Labyrinthfaktor und D M der Diffusionskoeffizient des Analytmoleküls in der mobilen Phase sind. Dieser Term ist proportional zur Zeit, welche die Substanzen in der Säule verbringen, also umgekehrt proportional zur Strömungsgeschwindigkeit in der Säule. Der Term ist vor allem in der Gaschromatographie wichtig. Massentransfer-Effekte: C s u + C M u Die Einstellung des Gleichgewichts zwischen mobiler und stationärer Phase wird vom Massentransfer der Analytmoleküle zwischen den zwei Phasen bestimmt. Man unterscheidet dabei den Anteil in der stationären und in der mobilen Phase. u Gleichgewichts einstellung Die Gleichgewichtseinstellung zwischen stationärer und mobiler Phase benötigt Zeit. Da die mobile Phase aber in Bewegung ist, kann sich der Gleichgewichtszustand nicht vollständig einstellen. Die Höhe eines theoretischen Bodens (HETP) wird dadurch vergrössert. C s u beschreibt die Verzögerung des Massentransfers aufgrund von Eigenschaften der stationären Phase. Die Dicke der stationären Phase hat den weitaus wichtigsten Einfluss auf diesen Term, aber auch der Diffusionskoeffizient des Analyten in der stationären Phase spielt eine Rolle. C M u beschreibt den Massentransfer in der mobilen Phase und wird auch Wirbel- Diffusion genannt. Der Term beschreibt u. a. die unterschiedlichen Weglängen, welche die Analytmoleküle in der Säule zurückzulegen. Dieser Faktor ist weitgehend von der Strömungsgeschwindigkeit unabhängig. Er ist in der Flüssigchromatographie wichtig. Graphische Darstellung der van-deemter-gleichung: HETP 15

10 Bodenhöhe (H) Minimum von H Optimale Fliessgeschwindigkeit Fliessgeschwindigkeit der mobilen Phase u 2.7 Auflösung Die Auflösung (R S ) zeigt an, wie gut die Peaks von zwei Substanzen voneinander getrennt sind. Sie kann direkt aus dem Chromatogramm berechnet werden. Eine hohe Auflösung erreicht man, wenn zwei Peaks möglichst weit auseinander liegen und eine scharfe Peakform aufweisen. R s = t R,B t R,A w A 2 + w B 2 (2.9) t B B normierte Signalhöhe h t M t A t A ' t B ' A Durch weitere Umformungen erhält man eine Beziehung, die R S als eine Funktion der Bodenzahl, des Selektivitätsfaktors α und des Kapazitätsfaktors k B beschreibt. R s = α 1 k B α 1+ k B 4 (2.10) Die Einflüsse von Trennfaktor (α), Retentionsfaktor (k) und Bodenzahl () auf die Auflösung (R S ): w A w B Zeit 16

11 R = 1.5! k 2.8 Optimieren einer chromatographischen Methode Bei praktischen Anwendungen ist es häufig wünschenswert, die Retentionszeiten zu verringern. Dabei muss jedoch dadurch geachtet werden, dass die Auflösung nicht zu klein wird.! " Unter Zuhilfenahme obiger Definitionen kann man die Retentionszeit darstellen als t R = 16R2 H u ( ) 3 α 1+ k B α 1 k B 2 (2.11) wobei u die Fliessgeschwindigkeit der mobilen Phase ist. Aus den Gleichungen (2.10) und (2.11) ist ersichtlich, dass die beiden Parameter R s und t R von α, k,, und im Falle von t R auch noch von H abhängen. Alle diese Faktoren können optimiert werden. 17

12 Auflösung R $ R S = " #1 ' k & )* 2 * % " ( 1+ k 2 4 Retentionszeit t R t R = 16R 2 SH u ( ) 3 % # ( " ' *" 1+ k 2 2 &# $1) k 2 Retentionsfaktor k α hängt von den Analyteigenschaften ab und kann u.a. verändert werden durch Variieren der Säulentemperatur, der stationären Phase (z.b. Veränderung der Polarität) oder mobilen Phase (z.b. Ändern des ph). Bei einer Veränderung der mobilen Phase kann oft eine bessere Selektivität erreicht werden, ohne dass die k-werte sich wesentlich ändern. k ist ein Parameter, der von der stationären Phase und dem Analyten abhängt. Oft erreicht man durch eine höhere Temperatur eine Erhöhung von k und damit eine bessere Auflösung. k-werte >10 erhöhen die Auflösung R s meist kaum mehr und haben nur noch eine verlängerte Retentionszeit zur Folge. Oft ist eine Auflösung bei Kapazitätsfaktoren zwischen 5-10 ideal. kann durch die Länge der Säule oder durch die Bodenhöhe verändert werden (siehe unten und Diskussion der van-deemter-gleichung). H wird stark beeinflusst durch die Flussgeschwindigkeit der mobilen Phase, sowie den Parametern, die in die van-deemter-gleichung einfliessen (Diffusionskoeffizient des Analyten in der mobilen und stationären Phase, Dicke der stationären Phase und Teilchengrösse der Packung). H = 2" # d p + 2k D # D M u $ f (d 2 + u# p,d 2 c ) & % D M + q# k # d 2 f oder 2t d # k (1+ k) 2 D S (1+ k) 2 ' ) ( Theoretische Bodenhöhe H Minimum H 1.! Kapillarsäulen A = 0 2.! Optimale u => Minimum der Terme B und C 3.! Dünne L-Filmdicke Minimaler H-Wert optimale u In der Praxis ist es oft üblich, die Bedingungen während eines chromatographischen Experiments zu ändern, da nicht alle Peaks bei den gleichen Bedingungen genügend 18

13 getrennt werden können. So wird z.b. in der Gaschromatographie sehr häufig die Temperatur während eines Experiments laufend erhöht und in der Flüssigchromatographie die Zusammensetzung der mobilen Phase (sog. Gradientenelution). Einfluss der verschiedenen Faktoren auf die Auflösung anhand eines Beispiels: unvollständige Auflösung k erhöhen! erhöhen erhöhen 2.9 ichtideale Elutionspeaks Symmetrische, gaussförmige Elutionspeaks lassen sich in der praktischen Anwendung leider oft nicht erhalten. Abweichungen von der Gleichgewichtsverteilung zwischen mobiler und stationärer Phase haben eine nichtideale Peakform zur Folge, wie auf folgender Darstellung ersichtlich ist. Fronting Tailing Peaksymmetrie Überlagerung und Reinheit Auflösung Trennleistung Lineare Isotherme (Idealfall): Konzentrationsunabhängige Verteilung zwischen mobiler und stationärer Phase. Folgen: Symmetrisches Signal; Retentionszeit nicht von injizierter Probenmenge beeinflusst 19

14 Tailing (häufig ormalfall) überladene Säule mit Komponenten relativ niedriger Retention: Wegen Übersättigung der stationären Phase werden grosse Probenkonzentrationen zu wenig stark zurückgehalten. Folgen: Verschiebung des Peakmaximums in Richtung kleinerer Retention, asymmetrisches Signal und Verkürzung der Retentionszeit bei hohen Probenkonzentrationen. Fronting (leading) überladene Säule mit Komponenten relativ hoher Retention: Tritt z.b. dann auf, wenn grosse Mengen von Probekomponenten in der stationären Phase kondensieren. Folgen: Asymmetrisches Signal und eine Zunahme der Retentionszeit bei grossen Probenkonzentrationen Quantitative Methoden Chromatographische Methoden hätten in den letzten Jahrzehnten wohl nicht die Wichtigkeit erlangt, wenn nicht sehr präzise quantitative Aussagen möglich wären. Man unterscheidet im wesentlichen drei Quantifizierungsmethoden: Die Quantifizierung mittels externem Standard, mittels internem Standard und die Standardaddition. Chromatogramm einer Probe! Qualitativ! Quantitativ! Strukturaufklärung! Identifizierung mit! bekanntem Stoff! Kopplung mit IR, UV/Vis, MR, MS! Mengenbestimmung! Kalibrieren! Peakzuordnung! Fragmentierung! Spektrendatenbank! Retentionszeiten! Retentionsindizes! selektiver Detektor! mit externem Standard! mit internem Standard! Standardaddition! Externer Standard In den Analyseproben werden die Peakhöhen oder Peakflächen der zu quantifizierenden Substanzen ermittelt, die dann anhand der Kalibrationsgerade (Konzentration Signalintensitäts Beziehung) in Konzentrationen umgerechnet werden. Ein achteil dieser Methode ist, dass die aufgetragenen Probemengen für die Standardproben und die Analyseproben genau übereinstimmen müssen. Da oft sehr kleine Mengen (µl) eingesetzt werden, kann dies zu grossen Fehlern führen. 20

15 Vom zu bestimmenden Stoff (Analyt) werden bekannte, verschieden konzentrierte Lösungen hergestellt, die als Standardproben dienen. Sie werden vermessen und zur Aufstellung der Kalibrierfunktion genutzt. Der Analytgehalt der Proben wird dann unter denselben Bedingungen wie die Standards gemessen und errechnet. In den eigentlichen Proben können unter Umständen Störungen auftreten, welche die Elution, oder Detektion des Analyten beeinträchtigen, die aber in den Standardproben nicht vorhanden waren und somit auch in der Kalibrationsgerade nicht berücksichtigt werden konnten. Interner Standard Bei dieser Methode werden den Standardproben eine oder mehrere zusätzliche Substanzen beigegeben, die man nicht in den Analyseproben erwartet (oft verwendet man markierte Verbindungen z.b. mit 13 C oder 2 H-Atomen). Diese Substanzen nennt man Interne Standards. Ein Beispiel: Bestimmung von Coffein in schwarzem Tee mittels HPLC. Standardlösung: 100 mgl 1 Coffein in Wasser als Stammlösung, 100 mgl 1 interner Standard Theophyllin. Probelösung: 1g Schwarzteepulver in 25 ml Theophyllin-Lösung kochen, durch einen Feinfilter reinigen und 100fach verdünnen. O CH 3 H 3 C O CH 3 Coffein Externer Standard H 3 C O O CH 3 Theophyllin H Interner Standard [KS] A[KS] [IS] A[IS] A[KS]/A[IS] KS Probe? Die Kalibrierstandards werden hergestellt, indem die Stammlösung des Coffeins verdünnt wird. Das Auffüllen mit Wasser wird erst nach der Zugabe des internen Standards zu allen Verdünnungen ausgeführt (beispielsweise: 80 µl Coffein-Stammlösung + 50 µl Theophyllin-Standardlösung µl Wasser = 1 ml Kalibrierstandard). Kalibrierstandards messen, Probe messen. Stets ist die Fläche unter dem Coffein-Peak und dem Theophyllin-Peak zur Auswertung heranzuziehen. Für die Kalibrationsgerade wird nun das Verhältnis der Peakhöhen oder Peakfläche von Analyt und internem Standard gegen die Konzentration des Analyten aufgetragen, wobei 21

16 für alle Messungen der Kalibrationsgerade die Konzentration des internen Standards gleich gross ist und die Konzentration der zu quantifizierenden Substanzen variiert wird. Zu den Analyseproben wird nun dieselbe Menge an Internem Standards zugegeben. Aus dem Verhältnis von Analyt und Internem Standard kann die gesuchte Konzentration des Analyten mit Hilfe der Kalibrationsgerade ermittelt werden. Diese Methode ist viel weniger anfällig auf Änderungen der Analysemengen. A Analyt A IntS = b + a C Analyt (2.13) Die Gehaltsberechung ergibt 33 mg g 1. Standardaddition Bei der Standardaddition werden mehrmals immer gleiche Probemengen von bekannten Konzentrationen des Analyten der Probe beigegeben. A P A P +IS = C P C P + C IS A P +IS = A P " (1+ C IS C P ) A P Peakfläche der Probe A P+IS Peakfläche der Probe und Standardzusatz C P [C] des Analyten in der Probe [C] des Analyten aus Zusatz C IS Durch Extrapolation der Messkurve auf den Schnittpunkt der Konzentrationsachse kann die Konzentration der Probelösung bestimmt werden. Peakfläche C IS = 0, A P +IS = A P A P +IS = 0, C p C(internStandard) Blindwert Zu jeder quantitativen Bestimmung gehört neben der Konzentrationsbestimmung der Probe auch eine Bestimmung des Blindwertes, womit Spuren des Analyten im Lösungsmittel und weiteren Reagenzien (z.b. Puffer) bezeichnet werden, sowie Verunreinigungen, die durch die Aufbereitung in die Probe gelangen. Zur Bestimmung des Blindwertes wird die Konzentration des Analyten in einer sogenannten Blindprobe bestimmt, die genau gleich zusammengesetzt ist (Lösungsmittel, Standards, ev. weiter Zusätze) und aufgearbeitet wird wie eine echte Probe, jedoch keine Probelösung enthält. Die Analytkonzentration in der Blindprobe muss von der Konzentration der Probelösung abgezogen werden um ein korrektes Messergebnis zu erhalten. 22

17 Zusammenfassung der quantitativen Analysen: Methode Bemerkung Formula Kalibrierung mit externem Standard identisch mit Analyt Analytenstandardlösung A = A 0 + f C stan dard Kalibrierung mit internem Standard sehr ähnlich wie Analyt Analytenstandardlösung A Analyt A IntS = b + a C Analyt viele systematische Fehler wie Verluste bei Anreicherung-, Wägeund Volumenfehler Kalibrierung mit Standardaddition identisch mit Analyt Analytenstandardlösung A P C = P A P +IS C P + C IS 23