Die Cytochrom c Reduktase Höherer Pflanzen

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1 - z/a o Die Cytochrom c Reduktase Höherer Pflanzen Charakterisierung des bifunktionalen Cytochrom c Reduktase / Processing Peptidase - Komplexes aus den Mitochondrien von Solanum tuberosum und Triticum aestivum Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften von Hans Peter Braun..«eingereicht am Fachbereich Biologie der Freien Universität Berlin im Juni 1993

2 INHALT 1. EINLEITUNG Der Cytochrom c Reduktase-Komplex und seine Rolle in der Atmungskette Der mitochondriale Protein-Import-Apparat Die Atmungskette und der Protein-Import-Apparat in den Mitochondrien höherer Pflanzen Zielsetzung der Arbeit MATERIAL UND METHODEN Material Chemikalien und Lösungsmittel Versuchsorganismen Grundmethoden der Proteinanalyse SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese Elektroelution Western Blotting Herstellung von Antikörpern Immunfärbung Antikörperfällung Enzymatische Proteinspaltung und HPLC-Auftrennung generierter Peptide Sequenzierung von Proteinen und Peptiden Präparation von Mitochondrien Isolierung von Mitochondrien aus Knolle, Sproß und Wurzel der Kartoffel Isolierung von Mitochondrien aus Weizen Isolierung von Mitochondrien aus Hefe und Neurospora Subfraktionierung isolierter Mitochondrien 23

3 2.4. Reinigung der Cytochrom c Reduktase aus den Mitochondrien höherer Pflanzen Solubilisierung von mitochondrialen Membranproteinen mit Triton X Affinitätschromatographie Druckfiltration Gelfiltration Saccharose-Gradientenzentrifugation Analyse der isolierten Cytochrom c Reduktase Spektrophotometrische Vermessung der Cytochrome Aktivitätsmessungen Spaltung des isolierten Enzymkomplexes Grundtechniken der Analyse von DNA Screening einer cdna-bank der Kartoffel Klonierung von DNA in Escherichia coli Sequenzierung von DNA Computeranalysen ERGEBNISSE Immunologische Charakterisierung der Cytochrom c Reduktase und der Prozessierungsprotease aus Kartoffel Identifizierung und submitochondriale Lokalisierung von PEP, MPP und der Core-Proteine Copräzipitation der Cytochrom c Reduktase und der Prozes- 35 sierungsprotease 3.2. Reinigung der Cytochrom c Reduktase aus Kartoffel Affinitätschromatographie Gelfiltrationschromatographie und Größenbestimmung Spektrophotometrische Vermessung der Cytochrome Oxidoreduktase- und Transhydrogenase-Aktivitäten des Proteinkomplexes Zusammenfassung des Reinigungsprotokolls 43

4 3.3. Analyse der Komposition der Cytochrom c Reduktase aus Kartoffel Immunologische Identifizierung der respiratorischen Untereinheiten und der Core-Proteine Analyse der Cytochrom c Reduktase mit verschiedenen Gelsystemen Cytochrom c Reduktase aus verschiedenen Sorten der Kartoffel Cytochrom c Reduktase aus verschiedenen Geweben der Kartoffel Molekulare Charakterisierung von Untereinheiten der Cytochrom c Reduktase aus Kartoffel Cytochrom b: Abtrennung des N-terminalen Methionins bei einem mitochondrial kodierten Protein Cytochrom ci: Eine zweigeteilte Leitsequenz für den Transport in den mitochondrialen Intermembranraum Bestimmung der Schnittstelle für das Eisen-Schwefel-Protein Bestimmung von N-terminalen und internen Aminosäuresequenzen der kleinen Untereinheiten, MPP und PEP sind integrale Bestandteile der Cytochrom c Reduktase aus Kartoffel Immunologische Identifizierung der Prozessierungsprotease als Bestandteil der Cytochrom c Reduktase aus Kartoffel Die drei Core-Proteine aus Kartoffel sind immunologisch unterscheidbar Das 51 kd-protein der Cytochrom c Reduktase aus Kartoffel ist homolog zu MPP Die 53 und 55 kd-proteine der Cytochrom c Reduktase aus Kartoffel sind homolog zu PEP Die Cytochrom c Reduktase aus Kartoffel ist eine Prozessierungsprotease DeStabilisierungen der Cytochrom c Reduktase aus Kartoffel: Abspaltung der MPP-Untereinheit Die Cytochrom c Reduktase aus Weizen Reinigung der Cytochrom c Reduktase aus Weizenkeimlingen Charakterisierung der isolierten Cytochrom c Reduktase Die Cytochrom c Reduktase aus Weizen ist eine Prozessierungsprotease 90

5 4. DISKUSSION Reinigung der Cytochrom c Reduktase höherer Pflanzen über Affinitätschromatographie und Gelfiltrationschromatographie Die Untereinheiten der Cytochrom c Reduktase höherer Pflanzen Die proteolytischen Untereinheiten Die respiratorischen Untereinheiten Die kleinen Untereinheiten Substöchiometrische Proteine in Cytochrom c Reduktase-Präparationen Die Stabilität der Cytochrom c Reduktase aus höheren Pflanzen Die pflanzliche Prozessierungsprotease ZUSAMMENFASSUNG LITERATUR ANHANG 128