10 Theorie Solubilisierung biologischer Membranen und Aktivitätstests von Atmungskettenkomplexen

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1 10 Theorie Solubilisierung biologischer Membranen und Aktivitätstests von Atmungskettenkomplexen 10.1 Solubilisierung biologischer Membranen In Lipiddoppelschichten verankerte Proteine und Proteinkomplexe lassen sich durch Detergenzien aus ihrer biologischen Membran extrahieren. Detergenzien sind amphipathische Moleküle, die sowohl polare als auch hydrophobe Gruppen enthalten. Sie aggregieren bei Überschreitung der kritischen mizellaren Konzentration (CMC) zu Mizellen. In solche Mizellen können hydrophobe Moleküle eingeschlossen werden. Mit ihrem hydrophoben Schwanz lagern sich Detergenzien in die Lipiddoppelschicht ein. Wenn eine ausreichende Menge an Detergens vorhanden ist, werden Membranen aufgelöst und es bilden sich Lipid-Detergens- sowie Lipid-Protein- Detergens- und Protein-Detergens-Mizellen Abb. 10.1: Solubilisierung biologischer Membranen [1] (10.1). Ein wichtiger Parameter bei der Solubilisierung ist das Detergens-zu-Protein-Verhältnis, angegeben in g/g. Weiterhin ist aber auch die Art des Detergens von entscheidender Bedeutung. Ionische Detergenzien solubilisieren zwar sehr effizient, verändern aber gleichzeitig die Struktur von Membranprotein(-komplex)en, so dass es zu einer Beeinträchtigung ihrer enzymatischen Aktivität bis hin zur vollständigen Denaturierung kommen kann. Um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu erhalten, müssen milde Detergenzien verwendet werden. Besonders gut eignen sich hierfür solche mit einer nicht-ionischen Kopfgruppe (z.b. Zucker- oder Oxyethylengruppen). Für den jeweiligen Verwendungszweck muss das richtige Detergens sowie dessen Konzentration experimentell ermittelt werden. Es sollte möglichst quantitativ das Zielprotein aus der Membran extrahieren, aber gleichzeitig seine physiologische Funktion nicht beeinträchtigen. Zur Solubilisierung gibt man eine definierte Menge Detergens zu einer Probe mit isolierten biologischen Membranen. Durch Inkubation bei geeigneten Temperaturen werden die Membranproteine allmählich extrahiert. Nicht-solubilisierte Membranbestandteile sowie Aggregate entfernt man anschließend durch Zentrifugation. Extrahierte Protein(-komplex)e bleiben, eingebettet in Detergens-Mizellen, im Überstand. Es werden hauptsächlich die beiden milden nicht-ionischen Detergenzien Digitonin und n-octyl- -D-glucopyranosid verwendet (Abb. 10.2). 1

2 Abb. 10.2a: Digitonin Abb. 10.2b: n-octyl- -D-glucopyranosid Für die Untersuchung der Aktivität der Atmungskettenkomplexe in blau-nativen Gelen wird Digitonin als Solubilisierungsdetergens verwendet. Die Membranproteine werden aus Rinderherzmitochondrien (BHM) mit einem Detergens zu Protein Verhältnis von 3 g / g solubilisiert. Durch Zentrifugation werden Membranreste und unsolubilisierte Proteine abzentrifugiert. Die solubilisierten Proteine befinden sich im Überstand und werden zur Auftrennung und weiteren Untersuchung auf ein BN-Gel geladen. Die Solubilisierungseffizienz von Digitonin liegt bei etwa 50%. Dafür bleiben aber Überstrukturen, wie die Superkomplexe der Atmungskette, erhalten. n-octyl-b-d-glucopyranosid wird durch die Betreuer zur Solubilisierung von Bacteriorhodopsin aus der Purpurmembran verwendet. Anschließend erfolgt im Praktikumsversuch die Rekonstitution von BR in Liposomen (siehe Skript 2 Photometrische Eigenschaften von Bacteriorhodopsin und Rekonstitution des Membranproteins in Liposomen ) In-Gel Aktivitätstests der Atmungskettenkomplexe (modifiziert nach: N. G. Heidrich, Superkomplexe aus Algen und Cyanobakterien - Isolierung, Charakterisierung und strukturelle Untersuchung, Dissertation TU Darmstadt, 2011.) Eine elegante Methode zum Nachweis von Proteinkomplexen ist die histochemische Färbung in nativen Gelen. Für Atmungskettenkomplexe z. B. existieren verschiedene Tests, bei denen Redoxreaktionen in Verbindung mit dem jeweiligen aktiven Enzym zu farbigen Niederschlägen führen. Aufgrund der Färbung der Proteinbande im Gel kann auf das entsprechende aktive Enzym zurückgeschlossen werden. Mit dieser Methode können ebenfalls Proteinsuperkomplexe, die aus unterschiedlichen Proteinkomplexen bestehen (z. B. I 1 III 2 IV 1 ), sowohl in der ersten nativen Dimension, als auch in mehrdimensionalen nativen Elektrophoresen nachgewiesen werden. Mittlerweile existieren für alle fünf Atmungskettenkomplexe (Komplexe I-V) aus Mitochondrien entsprechende Aktivitätstest-Protokolle [2]. Für den Praktikumsversuch werden Rinderherzmitochondrien (BHM) solubilisiert, auf ein BN-Gel aufgetragen und nach dem Gellauf die Tests für die Komplexe I und IV der Atmungskette durchgeführt. Hierfür wird das fertige Gel erst in Wasser inkubiert und danach in der Reaktionslösung geschüttelt, bis der farbige Niederschlag deutlich zu sehen ist. Mit der Stopp/Fixierlösung wird die Präzipitatbildung abgestoppt und die Proteine im Gel fixiert. Zum Schluss wird mit dem Scanner ein Bild aufgenommen und die Banden zugeordnet. Über eine zeitliche Ermittlung der Ausbildung des Präzipitats kann die Aktivität quantifiziert werden. 2

3 Aktivitätstest für Komplex I Der Test beruht auf der Reduktion des gelben Tetrazoliumsalzes NBT zu violettem Formazan durch das aktive Enzym NADH-Dehydrogenase, eine Untereinheit der NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (Komplex I) [3]. Ist eine Proteinbande mit diesem aktiven Enzym im Gel vorhanden, so färbt sich diese violett. Abbildung 10.3 fasst die ablaufenden Reaktionen während der Inkubation in der Testlösung bei Vorhandensein von aktivem Komplex I zusammen. Abb. 10.3: Ablaufende Reaktionen während des Aktivitätstests für Komplex I. Die NADH-Dehydrogenase oxidiert das Substrat NADH + H + zu NAD +. Die reduzierte Form von Komplex I gibt zwei Elektronen an das Tetrazoliumsalzes ab, welches dadurch zu violettem Formazan reduziert wird. Die Struktur für Komplex I ist nach Efremov et al. (2010) [4] modifiziert. 3

4 Aktivitätstest für Komplex IV Durch Umsetzung von 3,3 -Diaminobenzidin (DAB) zum entsprechend oxidierten Polymer wird die Aktivität des Proteinkomplexes sichtbar (braunes Präzipitat). DAB überträgt Elektronen auf in der Aktivitätstestlösung vorhandenes Cytochrom c. Komplex IV oxidiert Cytochrom c und nutzt die Elektronen zur Reduktion von Sauerstoff zu Wasser. In Abbildung 10.4 sind die wichtigsten Reaktionen dargestellt. Abb. 10.4: Nachweis von aktiver Cytochrom-c-Oxidase (Komplex IV) durch Oxidation von 3,3 -Diaminobenzidin (DAB) zum entsprechenden Polymer in nativen Gelen. Struktur von Komplex IV modifiziert nach Tsukihara et al. (1996) [5]. 4

5 In Abbildung 10.5 ist ein Beispiel für BN-Gelstreifen beladen mit Rinderherzmitochondrien zu sehen. Diese Abbildung sollte zur Beschriftung des eigenen Aktivitätstests herangezogen werden. Abb. 10.5: Mit 3g/g Digitonin solubilisierte Rinderherzmitochondrien (BHM), aufgetrennt in einem 3-13% BN-Gel, Coomassie gefärbt (links), in-gel Aktivitätstest I (Mitte) und IV (rechts) (modifiziert nach: L. Cavlovic und V. Decker, AG Dencher) 10.3 Literatur [1] Bhairi, S.M. und C. Mohan, Detergents-A guide to the properties and uses of detergents in biological systems. CB INTL Detergents Booklet. 2007, EMD Biosciences, San Diego, CA. [2] Wittig, I., et al., Electrophoresis, 28, , (2007). [3] Grandier-Vazeille, X. und Guérin, M., Anal. Biochem. 242, (1996). [4] Efremov, R.G., et al., Nature, 465, (2010). [5] Tsukihara, et al., Science, 272, (1996). 5