Proteinbiochemie/ Proteomics

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1 Hubert Rehm L -/A\ n n PO Proteinbiochemie/ Proteomics 5., erweiterte und überarbeitete Auflage Universitäts- und Lendesbibliothek Darmstadt Bibliothek Biologie * < '- - ELSEVIER SPEKTRUM AKADEMISCHER VERLAG AKADEMISCHER VERLAG

2 Inhaltsverzeichnis Vorwort zur 5. Auflage VII Dank VII Abkürzungen -. XIV Das Konzept des Experimentators 1 1 Das tägliche Brot Puffer herstellen Protein bestimmen BCA-Test Bradford-Test Lowry-Test.. > Der Starcher-Test (für geduldige Forscher) Pilztest Weniger beliebte, aber gute Methoden Gele SDS-Gele Für Eilige: SDS-Elektrophorese ohne Sammelgel Native Gele 14 f 1.4 Gele färben Fixieren Färben Trocknen Fällen und Konzentrieren Denaturierende Fällung Native Fällung Konzentrieren Blotten Proteinfärbung auf Blots Blocken Immunfärbung Ca 2+ -Bindung Ligandenfärbung Ablösen von Proteinen von Blots Autoradiographie von Gelen und Blots 35 2 Ligandenbindung Radioaktive Ligandenmarkierung Iodierung von Peptiden und Proteinen Iodierung von Molekülen mit niedrigem MG 43

3 X Inhalt Isolierung einzelner iodierter Spezies Vor- und Nachteile des Iodierens Tritiieren Bindung Isolierung von Membranen Bindungstest Bindungstests mit Membranen Entwicklung von Membranbindungstests Bindungstests mit löslichen Proteinen Keine Bindung, was tun? Auswertung von Bindungsdaten Die Bindung ist im Gleichgewicht Kinetik Vernetzen von Liganden Dreikomponentenvernetzung (3K-Vernetzung) Photoaffinitätsvernetzung Kontrollen bei Vernetzungsversuchen Sinniges Membranproteine solubilisieren Seifen Saubere Begriffe Vom Umgang mit Seifen Solubilisieren Solubilisierungskriterien Physikalische Parameter solubilisierter Membranproteine Wie werde ich die Seife wieder los? Proteinnachweis durch Funktionsmessung Translokatoren Liposomen Proteoliposomen Rekonstitution Rekonstitution aus einer Lösung Rekonstitution in vorgefertige Liposomen Fluxtest Influxtest Effluxtest Aufbauende Überlegungen 137

4 Inhalt XI 5 Säubern und Putzen Putziges Konventionelle Reinigungsmethoden Säulentechnik und HPLC Reinigung nach Größenunterschieden Reinigung nach Ladungsunterschieden Hydrophobe Chromatographie Das Blaugel ' 159 x Zeolit-Chromatographie Affinitätschromatographie Lektinchromatographie Ligandenchromatographie Die Reinheitsprobe Ausschlachten Antikörper Herstellung von polyklonalen Antikörpern Antigen Adjuvans Injektion und Serumgewinnung Reinigung von Antikörpern Immunpräzipitation Immunpräzipitation mit immobilisiertem Protein A Immunpräzipitation mit immobilisiertem Antikörper Nachweis präzipitierter Antigene mit biotinylierten Antikörpern Immunoaffinitätschromatographie Antikörper gegen ungereinigte Proteine Immunologische Nachweistechniken Dot-Blots Elisa Signalverstärkung bei Immunoassays Proteomics Einführung Probennahme Laserklebetechnik D-Gelelektrophorese Probenvorbereitung Vorfraktionierung Die zweidimensionale Technik 221

5 XII Inhalt 7.4 Proteine spalten Proteasenverdau Bromcyan- und Säurespaltung Massenspektrometrie von Proteinen und Peptiden Einführung Ionenquellen und Probenvorbereitung Analysatoren und Detektoren MS-Parameter und Spektreninterpretation Peptidmassen Fingerabdruck PSD-Massenspektrometrie Strukturanalyse mit Tandem-Massenspektrometrie oder Ionenfallen Peptidsequenzierung mit der MS Möglichkeiten der MS mit ESI-Quellen Möglichkeiten der MS mit MALDI-Quellen Bildgebende Massenspektrometrie MS-Strategie Proteinchips Antikörperchips Aptamere Passende Betrachtungen Austerbende Dinosaurier? Blockierte N-Termini Der Edman-Abbau Carboxyterminale Sequenzierung Proteomics-Philosophie Untereinheiten Stöchiometrie & Merigkeit Über die Schwierigkeiten bei Stöchiometriebestimmungen S&M mit Röntgenstrukturanalyse S&M mit Hybridisierungsexperimenten S&M mit Vernetzungsexperimenten S&M mit Aminosäureanalysen oder Antikörpern Was unsre Welt im Innersten zusammenhält Glykoproteine Wie, wo und wozu werden Proteine glykosyliert? Nachweis von Glykoproteinen in Gelen Nachweis von Glykoproteinen auf Blots Nichtselektive Glykoproteinfärbung Selektive (Lektin-)Färbung Deglykosylierung ; Glykosylierungshemmer 343

6 Inhalt XIII Endoglykosidasen Chemische Deglykosylierung Die Zuckerketten Monosaccharidzusammensetzung Aufbau und Sequenz Der Schatz im Silbersee Vom Paper Vom Schreiben eines Papers Durch die Wüste Unter Geiern Lieferanten Lieferanten gegliedert nach Produkten 370 Das Letzte 372 Register 373