Peptid- und Proteinanalytik II - am Beispiel der Proteomanalyse

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1 Peptid- und Proteinanalytik II - am Beispiel der Proteomanalyse Genom = Gesamtaustattung der Gene eines Organismus (statisch) Proteom = quantitative Darstellung des gesamten Proteinexpressionsmusters einer Zelle, eines Organismus oder einer Körperflüssigkeit unter genau definierten Bedingungen (dynamisch)

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3 Anwendung: Arzneistoffentwicklung 1. Analyse der molekularen Mechanismen von Krankheiten: Vergleich des Proteoms im gesunden und erkrankten Zustand º Identifikation von Proteinen, die im erkrankten Gewebe stärker oder schwächer exprimiert sind. Veränderte Expression kann Ursache oder Wirkung der Krankheit sein. 2. Suche nach neuen Targets: Identifizierung der Proteine, eventuell Untersuchung ihrer zellulären Funktion; 3. Suche nach neuen Arzneistoffen, die am Target wirken 4. oder: Screening von potentiellen Wirkstoffen, die zu einem gesunden Proteom führen 5. Targetbewertung: Erfassung der gesamten Wirkung einer Substanz auf Zelle oder Gewebe (Zellstoffwechsel, DNA- und Proteinsynthese,...) Entwicklung von Arzneistoffen gesund krank Vergleich Identifizierung der Proteine Entwicklung von Arzneistoffen

4 Methoden der Proteomanalytik 1. Trennung der Proteine: Elektrophorese Elektrophorese unter nicht-denaturierenden Bedingungen: Trennung nach Größe, Ladung und Molekülgeometrie Elektrophorese unter denaturierenden Bedingungen (SDS-PAGE): Zusatz des Detergens SDS (Natriumdodecylsulfat) und eines reduzierenden Thiols (z.b. Mercaptoethanol): Aufbrechen der Tertiär- und Quartärstruktur der Proteine und Überkompensation der Proteinladung º Trennung nur nach Molekulargewicht Problem: in einer Zelle sind ca Proteine vorhanden

5 Isoelektrische Fokussierung Elektrophoretisches Verfahren mit einem im Trenngel immobilisierten ph- Gradienten. Isoelektrischer Punkt eines Proteins (pi): ph-wert des Mediums, bei dem das Protein formal ungeladen vorliegt. Das Protein wandert im elektrischen Feld, bis es im Gel den ph-wert erreicht, der seinem pi entspricht. Dort erfolgt die Fokussierung der Proteinbande. Trennung erfolgt nur nach der Ladung/pI-Wert.

6 Hochauflösende zweidimensionale Elektrophorese 1. Dimension: Isoelektrische Fokusierung; 2.Dimension: SDS-PAGE

7 Vorteil: hohe Trennkapazität (mehrere tausend Proteine); hohe Beladbarkeit für präparatives Arbeiten.

8 Bildverarbeitung und Quantifizierung der Proteine: 1. Digitalisierung der Gele, z.b. durch Densitometer nach Silberfärbung 2. Spoterkennung und -quantifizierung durch Bildauswertungssoftware; Problem: fehlerbehaftet ( Fehler/2000 Spots) º Verwendung verschiedener Algorithmen º zeitaufwendig 3. Gelvergleich durch Bildauswertungssoftware; Erfassung und Darstellung von qualitativen und quantitativen Veränderungen im Proteinmuster; Problem: Verschiebung von Spots durch experimentelle Einflüsse 4. Datenanalyse (Vergleich mit anderen Experimenten, Datenbankrecherche, Darstellung der Ergebnisse) º Bioinformatik

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10 2. Identifizierung der Proteine: Massenspektrometrie Aufbau eines Massenspektrometers: Ionenerzeugung Elektronenstoßionisation (EI) Chemische Ionisation (CI) Massenanalysator Sektorfeldinstrumente Quadrupolinstrumente º Keine Analyse von Molekülen > 1000 Dalton

11 MALDI TOF MS (Matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry) Probe wird im 10 4 fachen Unterschuss mit den Matrixmolekülen cokristallisiert Matrixmoleküle (z.b. Nicotinsäure, Zimtsäure) absorbieren UV-Licht des Lasers und übertragen die Energie und Protonen auf die Analytenmoleküle, wodurch Desorption und Ionisation erfolgt Schonende Ionisation und Desorption; Nachweis von nichtflüchtigen Molekülen bis zu Dalton

12 TOF-Analysator: (Time of Flight = Flugzeit) Ionen werden durch konstante Spannung im elektrischen Feld beschleunigt und durchlaufen eine feldfreie Driftröhre (ca. 1m); Wenn alle Teilchen die gleiche kinetische Energie besitzen, ist die Geschwindigkeit indirekt proportional zur Masse; Durch Messen der Flugzeit (1 30 s) ist ein Rückschluss auf die Masse möglich Lineares Flugrohr Reflektor-Flugrohr (unterschiedliche kinetische Energie durch Beschleunigung wird teilweise kompensiert) Moleküle bis zu Da messbar Alternativ: Elektrosprayionisation und Ionenfallenanalysator

13 Shot gun Proteomics mit Proteintrennung: Shot gun: ohne Proteintrennung T: partieller enzymatischer Verdau der Proteine zu definierten Peptiden 1. Proteinisolierung, event. Analyse eines Subproteoms (z.b. Organelle oder Membran) 2. Partielle enzymatische Hydrolyse mit einer spezifischen Endoprotease (z.b. Trypsin, GluC) 3. mehrdimensionale Peptidtrennung, möglichst mit komplementären Trennverfahren, z.b. Größenausschluss-, Ionenaustausch-, oder Umkehrphasenchromatographie 4. zweidimensionale Massenspektrometrie 5. Bioinformatik: Massenspektren/shot gun Analyse Vergleich der praktisch gewonnenen MS/MS Spektren mit theoretisch errechneten Peptidframenten 6. Validierung der Ergebnisse z.b. durch Western Blot

14 zu 3. Mehrdimensionale Peptidtrennung (multidimensional protein identification technology = MudPIT) a) Offline Kopplung: Elution vom Kationentauscher durch einen Salzgradienten, RP Trennung durch einen Acetonitril/Wasser Gradienten b) Online Kopplung; stufenweise Elution vom Kationentauscher durch einen Salzgradienten Entsalzung in der RP Falle RP-Trennung Problem: Verdünnungseffekt SCX= Kationenaustauschchromatographie c) zweiphasige Mikrokapillare mit Kationentauscher und RP Material, die Probe wird offline aufgetragen, Elution durch abwechselnde Stöße mit zunehmender Salzkonzentration, die die Peptide nacheinander auf den RP-Teil eluieren, und Acetonitrilgradienten; + empfindlicher, da kein Verdünnungseffekt - nur Verwendung flüchtiger, MS tauglicher Salze

15 zu 4: MS/MS Kopplung Aufnahme eines MS-Spektrums: Detektion der Peptide nach ihrer Molekülmasse Fragmentierung eines spezifischen Peptids Aufnahme eines charakteristischen Zerfallspektrums, über das die Aminosäuresequenz ermittelt werden kann M b +1 + Fragmentierung M M c +1 + a +1 + M m/z m/z 600