Methoden der Proteomforschung. 2 D Gelelektrophorese

Transkript

1 Methoden der Proteomforschung Dr. Cornelia Kasper

2 Geschichte der Proteomforschung Proteinforschung viel älter als Genomforschung Spektakuläre Analysenergebnisse sind jedoch viel schwieriger zu erreichen als bei DNA-Analysen DNA ist aus nur 4 Bausteinen aufgebaut Proteine sind aus 20 verschiedenen AS aufgebaut; dazu kommen Modifikationen wie Phosphorylierung, Glycosylierung usw Der Begriff wurde 1996 geprägt Dr. Cornelia Kasper

3 Entwicklung Erste Strukturaufklärung eines Proteins 1953 (Frederik Sanger) Rinderinsulin (saure Hydrolyse, Peptide mittels Papierchromatographie aufgetrennt Pehr Edman Entwicklung automatisierter Sequenzierungsmaschine (Abbau von Polypeptiden vom N-Terminus aus) Bisher waren die Verfahren sehr zeitaufwendig, arbeitsintensiv und fehleranfällig Dr. Cornelia Kasper

4 Entwicklung der Massenspektrometrie Für die Proteinanalytik sind zwei Methoden geeignet: ESI - Elektrospray Ionisation Erzeugt mehrfach geladene Ionen ohne dass es zu Fragmentierung kommt resultiert in kleinen Werten für den Quotienten m/z MALDI Matrix assisted laser desorption ionisation Erzeugt einfach geladene Ionen Beide Methoden sind sehr empfindlich, schnell und schonend - Desorption ohne Beeinflussung der Fragmentierung und auch zur Charakterisierung posttranslationale Modifikationen geeignet Dr. Cornelia Kasper

5 Bisher einzige Methode zur Auftrennung von mehreren tausend Proteinen aus einer Zelle Bereits seit 1975 bekannt Erst seit wenigen Jahren sind die technischen Möglichkeiten erst ausreichend für die reproduzierbare Durchführung Sehr wichtige Technik da keine Alternative zur Aufklärung von Proteinfunktionen. Es gilt heute nicht mehr 1 Gen = 1 Protein, sondern die Situation ist sehr viel komplexer!!! Dr. Cornelia Kasper

6 Trennung von Proteinen nach: Isoelektrischer Punkt MW Oberfläche (hydrophil, hydrophob usw) Räumliche Struktur/Konformation Dr. Cornelia Kasper

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48 Zukunft von 2 D Gel? Für die Anwendung in der Industrie ist wegen Schwächen wie fehlende Automatisierung und Sensitivität nicht sonderlich attraktiv In der Pharma-Industrie wird 2 D Gel nur angewendet wenn es keine Alternative gibt Fazit: wird bereits von anderen Methoden zurückgedrängt, es müssen rasch wirkliche technische/methodische Verbesserungen für die Technik entwickelt werden, sonst besteht die Gefahr, dass sie ausstirbt. Alternative Methoden sind im Kommen Dr. Cornelia Kasper

49 Weitere Techniken in der Proteomforschung High performance liquid chromatography HPLC Capillary electrophoresis CE HPLC und CE sind direkt mit MS koppelbar! Free Flow Electrophoresis Dr. Cornelia Kasper

50 Weitere Techniken in der Proteomforschung Proteinchiptechnologie (z.b. Ciphergen) SELDI surface enhanced laser desorption ionisation Die Proteine werden auf einem Träger an Matrix gebunden (Ionenaustausch-Affinität-, Hydrophobizität) und dann direkt mittels MALDI TOF untersucht Sehr teuer Proteinarrays Proteine werden wie bei DNA-Arrays an aktivierter Oberfläche gebunden und anschliessend untersucht man funktionelle Ww mit anderen Biomolekülen Limitierung hier vor allem Auswahl der Affinitätsmoleküle Dr. Cornelia Kasper