Proteomanalyse: Probenvorbreitung in Gel Verdau und Reinigung

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1 Proteomanalyse: Probenvorbreitung in Gel Verdau und Reinigung Lkhagvadash Sanjaadorj Witri Wahyu Lestari 1 Überblick: Proteomanalyse Probe Elektrophorese Proteolyse Datenerfassung Dateninterpretation Datenbank 2

2 Inhalt Proteinfärbung Alkylierung und Reduktion von Proteine Proteine in-gel Verdau Extraktion von Peptiden (Proteinen) Konzentrierung und Entsalzung von Peptiden Automatisierung der Probenvorbreitung Identifizierung von Proteinen durch Massenspektrometrie Zusammenfassung 3 Proteinfärbung Proteinfärbung Coomassie Brilliant blau ng Silberfärbung 0,5 ng Fluoreszenz Färbung 0,5-5 ng 4

3 Proteinfärbung Coomassie Brilliantblau Silberfärbung Fluoreszenz färbung mit fast jedem Protein sensitivste Methode hohe Empfindlichkeit Kompatibilität zur MS unspezifisch Kopplung mit Fluoreszenzfarbstoff Lys in 0,025 ng Protein genaue Zeitpunkt achten Blau Silber 1ng Protein mit CBB Fluoreszenzscanner zur Detektion, teuer Hardware DIGE Differenz-Gel- Elektrophorese 5 In-Gel Verdau : Reduktion der Proteine 6

4 In-Gel Verdau: Alkylierung der Proteine 7 In-Gel Verdau: Spaltungen Spaltungen Chemische Spaltung Enzymatische Spaltung Gezielte Spaltung Unerwünschte Nebenreaktionen 8

5 In-Gel Verdau: gezielte Spaltung H O Spaltung am Methionin mit Bromcyan O N CH C CH 2 R 1 CH 2 N H R 2 Br H O N CH C N H R 2 CH 3 SCN S CH 3 O H 2 C CH 2 S CH 3 R 1 CN C N Sulfonium -Ion Br H 2 O R 1 -OC-HN CH C N-R 2 H 2 NR 2 H O N CH C H 2 O H N CH COOH H 2 C O C H 2 Iminolacton O R 1 H 2 C C H 2 O Homoserin-Lacton H 2 O O CH 2 R 1 CH 2 OH Homoserin 9 In-Gel Verdau: Nebenreaktionen Milde saure Hydrolyse oder hoch Temperatur Spaltung Asp-Pro Stark saure Hydrolyse: Spaltung überwiegend: N-terminalen Seite von Ser C-terminalen Seite von Asp Spaltung gering: N-terminale Seite von Thr auf beiden Seite von Gly 10

6 In-Gel Verdau: enzymatische Spaltung Trypsin(23 kda): Spaltung der C-terminalen Seite von Arg und Lys Keine Spaltung: wenn Prolin an C-terminalen Seite Gegenwart Ca 2+ aktiv 11 Wichtige Faktoren: ph, T, Puffer, Spaltungsdauer ph unmod. Trypsin mod. Trypsin Puffer NH 4 HCO 3 / Tris/HCl mmol/l Tris/HCl 2,5-5 mmol/l 7-9 7,8-8,1 ph 8,1 Entsalzung ohne Entsalzung ph=7,0, T=37 C, Inkubationszeit 16h Katalytische T C C Spaltungs dauer Reduzierung der Diffusionsstrecke 30 min mit der mikrowellen Bestrahlung 5-10 min mit dem Ultraschall 60 s 12

7 Extraktion von Peptide aus dem elektrophoretischen Gel Extraktionsmitteln: NH 4 HCO 3, Ameisensäure (ESI), Trifluoressigsäure (MALDI) und org. Lösungsmitteln (30-50%) Extraktionsausbeute: % 13 Extraktion von Proteinen aus Polyacrylamidgel Protein aus der Gelmatrix auf PVDF- Membran Optimierung: Extraktion im Ultraschallbad effiziente Extraktion für kleine Proteine bis zu 20 kda Verdauung des Proteins in Lösung oder auf eine inerte Membran 14

8 Concentration and desalting of peptides Concentration + desalting purification By hydrophobic interactions with vacuum centrifugation Zip Tips Hand packed microcolumns (bind to C 4 -C 18 ) Spin and pellet procedure Peptide fishing 15 Different media for purification procedures : RP-beads (RP-C4-C18) Polymer media (e.g. polystirene-based POROS bead) Synthetic membranes Commonly used chromt. material Stability at different ph Used for protein binding electroblotting 16

9 Purification method for proteomic standard procedures (most commonly used) Zip Tips Uses RP-C18 micro columns (millipore) Hand packed microcolumns Filled with a suspension of POROS 50 R2 RP-Chromt. material 17 ZipTip For concentrating and purifying femtomoles to picomoles of biomolecules ZipTip- Pipette Tips ZipTip is a 10 µl pipette tip with a 0.6 or 0.2 µl bed of chromatography media fixed at its end with no dead volume. 18

10 GELoader filled with POROS 50 R2 and ZipTip reversephase columns. The length of the column in the GELoader-tip is approximately 0.6 mm. This allows the sample to be concentrated and eluted in volumes 10 times smaller than with a ZipTip 19 20

11 new clean-up procedures Spin and pellet procedure Use POROS 50 R 2 RP- Chromt. Material in MeOH Vacum centrifugation Assisted by acidification with FA Peptide fishing Use PVDF or nitrocellulose membranes MeOH/MeCN eluted Suitable for low sample volumes (5,0-20 µl) 21 Global peptide coverage of different purification media and procedures Nitrocellulose Spin and pellet Anal Bioanal Chem (2007) 389:

12 Global peptide mass selectivity of different purification media and procedures Anal Bioanal Chem (2007) 389: Can not be considered as the sole factor purification efficiency 23 Hydrophobic properties of each clean-up procedures Spin pellet (e/-) Hydrophobic properties of: ZipTip (a), PVDF membranes (b), nitrocellulose membranes (c), micro-column procedure (d), and spin and pellet procedure (e) Anal Bioanal Chem (2007) 389: Nitrocellulose (c/+) 24

13 (A) PMF spectra obtained after MALDI-TOF measurements of bovine mitochondrial complex III (A), Anal Bioanal Chem (2007) 389: (B) PMF spectra obtained after MALDI-TOF measurements of bovine mitochondrial complex IV in-solution digests, with and without purification Anal Bioanal Chem (2007) 389:

14 Fig. 4 Average number of detected peptides for Complex III digested in solution, with and without purification, Anal Bioanal Chem (2007) 389: Fig. 5 Average number of detected peptides for Complex IV digested in solution, with and without purification, 27 Automation of sample preparation Automation via Flow-through reactors 30 protein samples simultaneously High throughput protein identification Gel washing Gel R/A washing R/A Cleavage Cleavage Extraction Extraction (resulting peptide) (resulting peptide) 2D electrophoresis based on protein transfer robotic system to PVDF blot Automated in gel digestion, especially liquid handling 28

15 Identification of proteins by MS 29 Zusammenfassung Welche Farbmethode am besten geeignet ist, hängt von Faktoren wie Zeitaufwand, Sensitivität der Färbung und der weiteren Verwendung des Gels nach der Färbung ab Modifizierte Cysteine sind in MS eindeutig identifizierbar Enzymatische Spaltung ist mild und spezifisch, daher auch bevorzugt Beide Extraktionswege ergänzen sich und geben ganz spezifische Aussagen 30

16 Summary Use of a purification procedure can promote the detection of significant peptides but, on the other hand, is always prone to unpredictable peptide losses. To achieve high-throughput protein identification, sample preparation must be automated. Data acquisition of peptide can be interpreted by PMF or with De novo sequence 31 Literatur Lottspeich F. and Engels J.W (2006) Bionalaytik 2.Auflage, 40; 44; 203; 204; 244;1004, Granvogl B, Plöscher M, Eichacker LA (2007) Anal Bioanal Chem 389: André M, Karas M (2007) Anal Bioanal Chem 389: Rappsilber J, Ishihama Y,Mann M (2003) Anal Chem 75: Zhukov A, Jansson Ö, Suckau D, Buijs J, (2002) BR (Biacore AB, Rapsgatan 7, SE-75459, Uppsala, Sweden; Bruker Daltonics, Fahrenheitstrasse 4, D Bremen, Germany) 32

17 DANKE 33 Fragen? 34

18 35 Peptide fishing (use membran) 36